編者按

當前，隨著類器官技術的發展，腫瘤類器官已被提議作為精準醫學的模型系統。由于腫瘤類器官的個性化特征，其在臨床前研究中也具有巨大的潛力。

近期，一篇重要綜述《Organoids: opportunities and challenges of cancer therapy》中，一張圖簡明扼要地總結了不同腫瘤類器官培養方法的關鍵。從腫瘤組織中通過機械或酶解獲得腫瘤細胞，用幾乎相同的基礎培養基進行培養，而細胞因子是腫瘤類器官培養成功的決定因素之一。今天，我們重點介紹幾種重要的腫瘤類器官培養基組分及方案——

01、胃癌類器官培養

通過構建源自胃癌患者的類器官（PDO），能夠直接對臨床樣本進行研究。Vlachogiannis 等人為了成功培養胃癌類器官，除了使用 ADMEM/F12 培養基和基底膜基質外，還添加了 EGF、Noggin、R-Spondin 1、FGF-10 等細胞因子。

胃癌患者的類器官（PDO）培養步驟：

如下實驗流程和數據均引用Vlachogiannis等人發表的文章（doi: 10.1126/science.aao2774），供參考。

1. 配置 PDO 培養基：改良的 DMEM/F12 基礎培養基，添加 1x B27 additive、1x N2 additive、0.01% BSA、2 mM L-Glutamine、100 units/ml 青霉素-鏈霉素，以及如下表的細胞因子或其他添加物：

*HGF 僅用于膽管癌類器官。

2. 樣本收集：通過圖像引導或內窺鏡手術收集活檢樣品。收獲后，樣本置于冷 PBS 中，并在冰上運輸到實驗室，20 分鐘～2 小時內將組織切片切碎。

3. 樣本處理：組織切碎后，加入 5 ml 5 mM  的 PBS/EDTA，室溫靜置 15 分鐘。用含有 2x TrypLe 的 1 mM PBS/EDTA 5 ml 在 37 ℃ 消化 1 小時。施加機械力（如吹液）以促進消化。

4. 接種細胞：用改良的 DMEM/F12 培養基收集分離的細胞，并在 4 ℃，1,200 轉/分離心 5 分鐘，使細胞成球狀，用 120 µl GFR 基質膠重懸，接種到 24 孔或 48 孔的平底細胞培養板中。

5. 將基質在 37 ℃、5% CO2 的細胞培養箱中培養 20 分鐘，進行固化。然后添加 500 µl 配置好的 PDO 培養基，要完全覆蓋培養孔。

6. 每兩天換一次培養基。

腫瘤類器官培養主要步驟

02、肝癌類器官培養

腫瘤類器官的培養非常復雜，如肝癌類器。原發性肝細胞癌主要分為肝細胞癌（HCC）、膽管細胞癌（CC）和混合型（CHC）。在肝細胞癌類器官培養中需要使用地塞米松但是膽管細胞性肝細胞癌類器官培養則需加入 R-spondin 1 來維持細胞生長。

Broutier 等人發現原發性肝癌（PLC）組織培養獲得的類器官可以在體外真實地模擬人類 PLC 的遺傳復雜性。構建的類器官包含 PLC 常見的三種亞型：HCC、CC 和 CHC，再現親本腫瘤的組織結構和表達譜，同時保留患者及亞型之間的差異性，有利于肝癌相關基因和潛在生物標志物的鑒定。

肝癌類器官分類培養基：

如下實驗流程和數據均引用 Broutier 等人發表的文章（doi: 10.1038/nm.4438），供參考。

1. 基礎培養基：改良的 DMEM/F12 培養基，添加 1% 青霉素-鏈霉素、1% Glutamax、10 mM HEPES 和 1:50 B27 添加劑。

2. 經典人肝類器官分離培養基：Wnt 條件培養基、R-Spondin 1 條件培養基和基礎培養基按照 30%、10% 和 70% 的體積比混合，然后加入 1:100 N2 添加劑、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重組人 Gastrin I、50 ng/ml 重組人EGF、100 ng/ml 重組人 FGF10、25 ng/ml 重組人  HGF、25 ng/ml Noggin、5 uM A83-01、10 uM Forskolin、10 uM Y27632。

3. 腫瘤細胞特異性分離培養基：經典人肝類器官分離培養基中添加 3 mM 地塞米松。

4. 肝癌類器官培養基：基礎培養基、10% （體積比）R-Spondin 1 條件培養基、1:100 N2 添加劑、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、10 nM 重組人 Gastrin I、50 ng/ml 重組人 EGF、100 ng/ml 重組人 FGF10、25 ng/ml 重組人 HGF、5 uM A83-01、10 uM Forskolin。

03、結直腸癌類器官培養 

患者來源的腫瘤類器官已成為結直腸癌臨床前研究的一種出色的模型，原代上皮細胞可在特定生長因子的控制下和 3D 細胞外基質（ECM）中成功培養類器官。腸上皮細胞的自我更新由位于隱窩中的 Lgr5 干細胞驅動。Wnt 信號是維持隱窩干細胞活躍所必需的，Wnt 激動劑 R-Spondin 1 是 Lgr5 的配體，誘導隱窩增生。EGF 信號與腸道增殖有關，Noggin 誘導隱窩數量的急劇增加。

因此，van de Wetering 等人開發的結直腸癌類器官培養體系如下：

如下實驗流程和數據均引用 van de Wetering 等人發表的文章（doi: 10.1016/j.cell.2015.03.053），供參考。

1. 基礎培養基：改良的 DMEM/F12 培養基，添加青霉素-鏈霉素、10 mM HEPES 和 Glutamax。

2. 人腸干細胞培養基：Wnt 條件培養基、R-Spondin 1 條件培養基、Noggin 條件培養基和基礎培養基按照 50%、20%、10% 和 20% 的體積比混合，然后加入 1x B27、1.25 mM n-Acetyl Cysteine、10 mM Nicotinamide、50 ng/ml 人 EGF、10 nM Gastrin、500 nM A83-01、3 uM SB202190、10 nM Prostaglandine E2 和 100 mg/ml Primocin。

3. H&E 染色分析：通過 H&E 染色對培養后的原代腫瘤細胞和類器官進行分析，發現大多數類器官的特征是存在一個或多個管腔，與原代腫瘤的管狀結構相似（如 P8 和 P19b），沒有管腔的原代腫瘤會形成沒有管腔的緊湊型類器官（P19a）。

腫瘤類器官與原代腫瘤上皮相似

04、乳腺癌類器官培養

乳腺癌類器官的培養基與其他腫瘤的略有不同。Seino 等人在類器官培養基優化過程中發現，Neuregulin 1 與乳腺發育和腫瘤發生有關，將其添加到培養基中可維持類器官有效再生和長期增殖（超過 20 代）。Wnt-3A 對類器官培養條件改善不明顯。EGF 對乳腺癌類器官培養具有雙重作用，高于 5 ng/ml 促進細胞增殖，但會導致類器官解體，失去自組織功能，低濃度則相反。

Hans Clevers 等構建乳腺癌類器官的培養基組分：

如下實驗流程和數據均引用 Hans Clevers 等人發表的文章（ doi 10.1016/j.cell.2017.11.010 ），供參考。

a：類器官出現解體時減少或不添加，b：濃度超過 1 μM 會降低類器官生成效率

05、肺癌類器官培養

肺癌是全球常見的惡性實體腫瘤，但是肺癌早期臨床表現不明顯，容易與其他感染混淆而被忽視，一般確診時已發展到中晚期，因此，及時準確地篩選合適的抗腫瘤藥物對肺癌患者非常重要。

1 份從原發性腫瘤組織中衍生出肺腺癌類器官（成功率達到 80%）的培養基組分：

如下實驗流程和數據均引用Zhichao Li等人發表的文章（10.1016/j.xpro.2020.100239 ），供參考。

試劑詳細配制指南

關鍵：所有操作都應在二級生物安全柜中進行，以保持無菌狀態。

1、200 μg/mL FGF-10 (10,000 X)

a. 取100 μg溶于0.5 mL 無菌的 PBS（加 0.1% BSA，質量/體積）。

b. 每管 5 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個月。

2、250 μg/mL FGF-7 (12,500 X)

a. 取 100 μg 溶于 0.4 mL 無菌的 PBS（加 0.1% BSA，質量/體積）。

b. 每管 4 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個月。

3、100 μg/mL R-spondin 1 (200 X)

a. 取 250 μg 溶于 2.5 mL 無菌的 PBS（加 0.1% BSA，質量/體積）。

b. 每管 250 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 1 個月。

4、100 μg/mL Noggin (1,000 X)

a. 取 100 μg 溶于 1 mL 無菌的 PBS（加 0.1%  BSA，質量/體積）。

b. 每管 50 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 2 個月。

5、100 mM Y-27632 dihydrochloride (10,000 X)

a. 取 50 mg 溶于 1.56 mL 的超純水中。

b. 用 0.22 μm 的過濾器過濾溶液。

c. 每管 5 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 6 個月。

6、500 mM N-Acetylcysteine (400 X)

a. 取 408 mg 溶于超純水，至終體積為 5 mL。

b. 用 0.22 μm 的過濾器過濾溶液。

c. 每管 125 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個月。

7、2 M Nicotinamide (200 X)

a. 取 6.1 g 溶于 1x PBS，至終體積為 25 mL。

b. 用 0.22 μm 的過濾器過濾溶液。

c. 每管 250 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個月。

8、30 mM SB202190 單鹽酸鹽水合物 (3,000 X)

a. 取 5 mg 溶于 0.453 mL 的二甲基亞砜（DMSO）中

b. 每管 16.67 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的黑色離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個月。

關鍵：不要用聚偏二氟乙烯（PVDF）膜過濾含有 DMSO 的溶液，因為 DMSO 可以溶解這種膜。

關鍵：使用黑色離心管，防止該溶液受到光照。

建議：過濾 DMSO 溶液，可以使用 DMSO 安全過濾器或尼龍膜過濾器。

9、25 mM A83-01 (50,000 X)

a. 取 5 mg 溶于 0.474 mL 的二甲基亞砜（DMSO）中

b. 每管 2 μL，將溶液分裝到 1.5 mL 的離心管中，可在 -20 ℃ 保持 3 個月。

10、分裝基質膠

a. 取一瓶新的基質膠，放于 4 ℃ 冰箱中解凍 8 小時。

b. 將瓶子倒置幾次，使其充分混合。

c. 取 1.5 mL 的離心管置于冰上冷卻。

d. 將基質膠和 1.5 mL 的離心管置于冰上，按實驗所需體積將基質膠分裝到 1.5 mL 的離心管中，并在 -20 ℃ 保存。

關鍵：移液器槍頭應在抽吸基質膠之前，為了防止基質膠黏在槍頭上，應通過多次抽吸和排出冷的無菌 PBS（含 01.% BSA）進行預濕和預冷。

注意：基質膠是一種重組基膜制劑，富含胞外蛋白，應避免反復凍融。

06、卵巢癌類器官培養

 目前，培養卵巢癌類器官的方法有多種，但成功率較高的是使用基質膠和改良 DMEM/F12 基礎培養基的組合，并輔以 EGF、FGF2、FGF10、Noggin、Rspondin1、p38 抑制劑等，可使類器官培養成功率達到 80%～90%。

Senkowski 等人為了獲得高級別漿液性卵巢癌（HGSC）類器官的長期培養方案，對培養基添加組分進行優化，獲得兩種成功率更高的配方。并且體外培養的 HGSC 類器官保留了原始腫瘤的基因組和表型特征，其藥物反應與臨床結果具有相關性。

培養基優化主要涉及添加物種類和濃度，尤其是細胞因子類。

研究人員在改良型 DMEM/F12 培養基中加入 Glutamax、Primocin、N-acetyl-cysteine 和 B27 添加劑構成基礎培養基。通過分析添加劑對 HGSC 原代細胞短期類器官形成和生長的影響，使用添加 FGF-10、SB202190 和 A83-10 的基礎培養基（M 0.1）進行優化。但 M 0.1 培養基能促進生長，但在傳代后并不能維持生長。進一步確定 HGSC 類器官培養基配方中加入了 5 mM 煙酰胺，形成培養基 M1。

在培養基 M1 中添加 EGF、Heregulin-β-1、Hydrocortisone 和 Forskolin，形成培養基 M2。對于不同的樣品，M2 可能具有促進或抑制類器官生長的「矛盾」結果，因此為了最大限度地提高類器官形成，每個 HGSC 樣品應在兩種不同的培養基 M1 和 M2 中平行培養。

類器官形成和長期培養測試的主要因子及其影響概述：

腫瘤類器官與原代腫瘤上皮相似

07、其他腫瘤類器官培養

膀胱癌類器官利用 CTOS 培養基進行培養，主要成分為改良型 DMEM/F12、B27、A83-01，需補充添加 FGF10、FGF7、HER3。

培養前列腺類器官時，一般會加入 FGF10、FGF2、p38 抑制劑 SB202190、Rho 激酶抑制劑等，而小鼠前列腺癌類器官無需添加 FGF10、FGF2、PGE2、煙酰胺和 SB202190……

總之，不同腫瘤類器官培養需要添加不同組合的細胞因子，以促進或抑制參與類器官形成的信號通路，獲得所需的類器官。腫瘤類器官培養作為一種具有廣泛應用前景的技術，通過不斷優化和完善培養方法，有望為腫瘤研究和治療提供新的突破。