01研究背景
對乙酰氨基酚(APAP)是一種廣泛使用的止痛藥，但過量攝入或高危人群誤用時可引起肝損傷。NEDD4-1是一種E3泛素連接酶，與許多肝臟疾病的發病機制有關;?但其在APAP誘導的肝損傷(AILI)中的作用尚不清楚。近期，吉林大學動物醫學院李心慰和劉國文教授團隊在“Acta Pharmaceutica Sinica B, IF 14.903”上發表文章“The E3 ubiquitin ligase NEDD4-1 protects against acetaminopheninduced liver injury by targeting VDAC1 for degradation”，揭示了NEDD4-1在AILI中的作用機制，為AILI的治療提供了一個新的靶點。
NEDD4-1是APAP誘導肝損傷的抑制因子
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維真助力：AAV載體
實驗動物
雄性C57BL/6N小鼠（4-8周）
病毒產品
AAV8-TBG-NEDD4-1;
AAV8-shVDAC1
注射方式
尾靜脈注射（200μL）
病毒用量
2.5×1011?VG
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02結果展示
1.?肝細胞NEDD4-1缺失加重APAP誘導的肝損傷和壞死
作者在小鼠腹腔注射過量APAP，構建AILI模型，發現肝細胞NEDD4-1的表達在AILI中顯著下調，且與肝損傷嚴重程度呈負相關。NEDD4-1缺失研究發現，肝細胞特異性NEDD4-1敲除小鼠（KO小鼠）在APAP的刺激下，產生了更嚴重的肝損傷，表現為血清ALT、AST、LDH和HMGB1水平顯著升高。RNA-seq數據和GSEA分析表明KO小鼠中上調的基因與趨化因子、炎癥小體、DNA損傷、腫瘤壞死因子信號通路和細胞死亡途徑相關。作者還利用體外實驗再次驗證了上述結果。
圖1.?NEDD4-1缺失加重APAP誘導的肝損傷
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2.?過表達NEDD4-1可緩解APAP誘導的肝損傷
為了進一步證實肝細胞NEDD4-1在AILI中的功能，作者使用AAV8-TBG-NEDD4-1構建肝細胞NEDD4-1過表達小鼠。APAP刺激下，NEDD4-1過表達小鼠肝臟損傷和壞死減輕，壞死面積減少，存活率提高。體外實驗獲得的結果與體內實驗結果一致，表明肝細胞NEDD4-1過表達可以改善APAP誘導的肝損傷和壞死。進一步的研究表明，肝細胞NEDD4-1缺失加重了APAP誘導的線粒體損傷，表現出更嚴重的線粒體功能缺陷。但NEDD4-1過表達有效緩解了上述癥狀。表明NEDD4-1部分介導了APAP誘導的肝細胞線粒體損傷。
圖2.?NEDD4-1過表達可緩解APAP誘導的肝損傷
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3.?VDAC1下調減輕肝細胞NEDD4-1缺失導致的肝損傷
作者發現NEDD4-1在AILI中顯著影響VDAC1蛋白的豐度，并與其成負相關。為了確定VDAC1是否參與了NEDD4-1在AILI發病過程中的調控，作者利用AAV8-shVDAC1構建了VDAC1沉默小鼠，發現APAP處理下，VDAC1沉默顯著減輕小鼠的肝損傷和壞死并緩解肝臟線粒體損傷。更重要的是，VDAC1的敲除緩解了由NEDD4-1缺失引起的肝損傷增強，這些體內現象在體外實驗中被進一步證實。進一步的研究表明NEDD4-1在APAP毒性中調控VDAC1的寡聚。
圖3. VDAC1下調減輕NEDD4-1缺失導致的肝損傷
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4.?VDAC1作為NEDD4-1泛素化底物的鑒定
APAP處理后VDAC1蛋白豐度的增加但轉錄本含量不變，同時NEDD4-1過表達顯著降低了VDAC1的蛋白質豐度，這種影響被蛋白酶體抑制劑MG132阻斷，而不被溶酶體抑制劑CQ阻斷，表明NEDD4-1調節VDAC1的蛋白酶體降解。泛素化實驗表明，NEDD4-1顯著促進了VDAC1的泛素化，但缺乏泛素連接酶活性的NEDD4-1突變體則無法實現上述功能，表明NEDD4-1催化VDAC1的泛素化依賴于其E3泛素連接酶活性，賴氨酸泛素化類型篩選結果表明，NEDD4-1促進了VDAC1的K48連接的泛素化，表明VDAC1是NEDD4-1泛素化底物。
圖4.?VDAC1是NEDD4-1的泛素化底物
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03實驗結論
本研究表明NEDD4-1通過促進VDAC1在肝細胞中的泛素化降解，緩解了AILI。這使得NEDD4-1-VDAC1通路成為治療AILI的一個有希望的靶點，并為此類疾病及其相關病理的治療提供了新的可能性。
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