小鼠皮下成瘤是一類經典的體內實驗模型，廣泛用于研究腫瘤細胞的生長特性、藥物篩選以及抗腫瘤機制等。但在實際操作中，模型的建立卻往往面臨諸多挑戰，那么今天我們就帶大家好好地盤一盤，看看怎樣才能成功建立起這個模型。

01 實驗材料準備

1.實驗動物

通常選用免疫缺陷小鼠，如裸鼠（nu/nu）或嚴重聯合免疫缺陷小鼠（SCID）。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周齡的成瘤速度有所差異，建議根據預實驗結果選擇合適的動物模型，同時參考已發表的文獻。

選擇小鼠周齡不宜過大，如，裸鼠8周齡以上NK細胞等免疫細胞活力開始增強，一般來說，4～6周齡的裸鼠更容易成瘤，這時免疫系統不夠強，成瘤率相對較高。

2.細胞選擇

根據實驗目的選擇合適的腫瘤細胞株。

02 實驗步驟

1.細胞準備

收集指數生長期、密度在80-90%的腫瘤細胞，至無菌離心管中。細胞在4℃，1500rpm離心5min，去除上清液并將細胞均勻重懸于1mL PBS中，離心清洗2-3遍。

使用胰酶消化細胞。加入PBS或無血清培養基制成細胞懸液，離心清洗1-2次去除胰酶，重懸至終濃度為1-5×10⁸個細胞/mL（供參考，可根據實際情況進行調整），置于冰盒中。

2.細胞接種

接種部位選擇：通常選擇小鼠右側或左側腋窩下或背部皮下。一般認為腋下皮下血供充足，利于腫瘤細胞增殖，且右側操作較方便。

如果個別瘤種生長速度較快，可以接種后肢或背部等供血量不是特別充足的地方，或者降低細胞接種劑量，減緩腫瘤生長速度。

接種：將上一步的細胞懸液與基質膠按1：1混合，制備成終濃度為1-5×10⁷個/mL的細胞懸液，用1mL注射器吸取0.1mL細胞懸液（約含1-5×10⁶個細胞）。

在接種前，使用槍將細胞懸液充分吹散，以確保細胞均勻分散，防止細胞聚集并降低其存活率。

在小鼠皮下緩慢注射，注射過程中要保持針頭穩定，避免細胞外漏。

接種操作：接種時，用拇指和食指抓住小鼠肩膀上的皮膚，防止小鼠將注射器踢開，使其保持在直立位置。用75%乙醇棉球輕輕消毒皮膚2-3次。輕輕地將針插入皮膚以到達皮下。

輕輕推入注射器中的細胞，在拔出針頭之前停留幾秒鐘，以防細胞懸液漏出。

3.腫瘤生長監測

接種后將小鼠放回籠中飼養，每天觀察小鼠的精神狀態、飲食情況以及接種部位腫塊出現和生長情況。大約1周-1月左右可看到腫瘤出現。

腫瘤體積測量：從第3天開始，每隔2天用游標卡尺測量腫瘤的長徑（a）和短徑（b），根據公式V=（a×b²）/2計算腫瘤體積。

體重測量：定時測量小鼠體重，記錄體重變化情況。

4.終止與取材

終止標準：當腫瘤體積達到1000mm³時對小鼠進行安樂死。

取材：用剪刀剪開皮膚，完整取出腫瘤組織。將一部分凍存于液氮中，以備將來提取蛋白質和RNA使用；另一部分則放入4%多聚甲醛溶液中固定，用于后續的組織學分析。

03 注意事項

1.無菌操作：整個實驗過程需在超凈工作臺內進行，嚴格遵守無菌操作原則。細胞培養操作過程要注意防止污染。支原體污染極為常見，會改變培養細胞的代謝、增殖特征及形態等，從而影響腫瘤生長和結果的可重復性。建議接種前對細胞進行支原體檢測。

2.細胞狀態：確保細胞在注射前處于良好的生長狀態，無污染，細胞活性大于90%。細胞活力是影響腫瘤形成的重要原因，接種細胞建議取處于對數期生長的細胞，接種前對細胞活率進行檢測，接種過程中細胞置于冰上，保持低溫，接種完成后也可以留一小部分細胞檢測細胞活率，確保接種過程中細胞活率沒有明顯降低。另外，注意避免體外過度傳代影響細胞狀態（一般3-5代）。

3.接種技巧：接種時要緩慢，避免細胞團塊形成。注射前，一定要排去針管內的空氣。在接種時，針頭應深入皮下約1厘米，以減少注射后細胞懸液從針眼溢出的可能性。注射時，針頭應向前方穿行，且在注射前輕微移動針頭，以確保針頭處于皮下。如果針頭能夠移動，則表明它在皮下位置，否則可能在皮內或肌肉內。保證每只小鼠接種的細胞數一致。

04 結果分析

1.腫瘤生長曲線繪制：以時間為橫坐標，腫瘤體積為縱坐標，繪制腫瘤生長曲線。通過比較不同組別的腫瘤生長曲線，可以直觀地觀察到腫瘤的生長趨勢。

2.腫瘤重量分析：將取出的腫瘤組織稱重，計算平均腫瘤重量，比較不同組別之間的差異。

3.組織學分析：對固定后的腫瘤組織進行石蠟包埋、切片、HE染色等處理，觀察腫瘤的組織結構、細胞形態以及血管生成等情況。

05 常見問題

1.腫瘤不生長或生長緩慢

原因：可能是細胞活性不足、注射部位不準確或小鼠個體差異等原因。

解決方法：確保細胞在注射前處于良好的生長狀態，調整注射部位和注射技巧，選擇健康的小鼠進行實驗。

2.腫瘤壞死或感染

原因：可能是注射過程中細胞外漏、注射量過多或小鼠感染等原因。

解決方法：嚴格控制注射量，避免細胞外漏，加強小鼠飼養環境的衛生管理，及時處理感染的小鼠。

3.小鼠死亡率過高

原因：可能是麻醉劑量過大、腫瘤生長過快導致小鼠負擔過重或實驗操作不當等原因。

解決方法：準確控制麻醉劑量，定期監測小鼠的腫瘤生長情況，及時終止實驗，避免實驗操作對小鼠造成不必要的傷害。

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