核心摘要
越來越多的證據表明腸道微生物組可能對神經系統過程和行為產生影響。在這項研究中，我們使用新型水箱試驗（NTT）來分析斑馬魚在補充具有探測到的抗氧化劑和抗炎特性的益生菌4個月后的探索行為。結果表明，長期攝入鼠李糖乳桿菌CECT8361和長雙歧桿菌CECT7347會明顯改變斑馬魚模型的游泳方式和平均游泳速度。經過處理后，斑馬魚放到新的水箱中后，極大地降低了其缸底行為，這可能與焦慮程度較低有關。
文｜大衛·G·瓦爾卡塞，胡安·M. ·馬丁內斯-巴斯克斯，Marta F. Riesco，Vanesa Robles
文章發表于《Heliyon》 6（2020）e03973
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2405844020308185
（本文在翻譯中做了部分節選）
一、綜述
益生菌的使用不斷增加，拓寬了我們對腸道微生物組和細菌代謝物的組成通過不同的調節途徑對神經和行為過程的相關影響的認識。近年來，大多數研究都集中在人類或其他哺乳動物上，然而，使用斑馬魚模式生物已比較常見。這是因為，它們很容易人工飼養繁殖，并且它們的一些神經通路與哺乳動物的神經通路具有高度同源性。
斑馬魚（Danio rerio）作為一種模式生物，其益生菌實驗的結果可以用作人類治療的參考，因為它們具有相似的腸道微生物群和定殖模式。新型水箱試驗（NTT），是用來測試斑馬魚焦慮相關行為的最廣泛使用的實驗程序之一，這是基于它們自然的偏好，即首次將其放置在新型水箱中時會在底部附近游泳。人們通常認為魚離開魚缸底部并開始探索其他區域之前，斑馬魚所花費的時間差異反映了它們所經歷的焦慮。多項研究使用這種方法分析了不同物質對魚類生長的影響，觀察到與地西epa，丁螺環酮等抗焦慮藥和氟西汀等呈正相關。然而，尚未深入研究益生菌攝入對行為反應的附帶影響，在某些情況下對壓力的反應有所降低，而在其他情況下則沒有直接的相關性。因此，觸發此響應的機制仍不清楚。
在本研究中，我們分析了給予鼠李糖乳桿菌CECT8361和長雙歧桿菌CECT7347菌株的益生菌混合物（1：1）的斑馬魚成魚的探索行為如何受到影響，這已經證明它們對改善人類和斑馬魚的生精性能方面的作用。
二、實驗方法及新型水箱測試：
這項研究使用了兩組成年野生斑馬魚（AB品系）。將所有魚飼養在3升的水箱中，并從配備有機械、化學和生物過濾器的再循環系統交換恒定的水。將水保持在26°C的平均溫度，房間以14/10的明暗周期進行。
為了評估益生菌施用對魚類行為的影響，為每個組提供了4個月（2018年12月至2019年3月）的不同喂養方式。在行為測試前一個月，將每只魚在110 mg / L的三卡因甲磺酸緩沖液（MS222）中進行麻醉，并分別用可見的植入彈性體進行標記（Northwest Marine Technology，WA，USA）。在實驗期間，CTRL的一條魚死亡。
將四邊形玻璃水族箱（20×8×18 cm；長×寬×深）填充至總體積為3.5 L，并將其用作評估場所。使用網將每條魚分別放置在水箱底部，并記錄其游泳行為（1920×1080 px），持續6分鐘。試驗結束后，將魚與不同組的幼稚魚分開轉移到回收池中。使用NoldusEthovision?跟蹤軟件分析了視頻文件，生成了一個虛擬網格，將儲罐在上下區域的一半深度處分開。確定每個區域所花費的時間（以占總時間的百分比表示），區域之間的穿越次數、平均速度、移動的總距離以及第一次穿越上方區域的等待時間。
三、實驗結果：
當將魚放置在新的環境中時，其本能會在水柱底部引發保護性潛水行為，從而降低了被更接近水面的潛在捕食者襲擊的風險。
新型水箱試驗（NTT）是基于此響應在斑馬魚行為實驗中常用的測試。該測定法可以被定義為嚙齒動物開放視野范例的類似物。因此，由于NTT在“安全”潛水行為與“探索”游泳行為之間存在沖突，因此可以研究在特定實驗條件下魚的趨地逃逸潛水本能的強度。
在正常受控的實驗室條件下，斑馬魚通常在監測的前幾分鐘傾向于在水箱底部花費更多的時間，顯示出較高的不穩定運動和不動事件發生率。適應期過后，斑馬魚逐漸探索水柱的上部。我們的結果表明，成年斑馬魚以抗氧化劑和抗炎混合物的益生菌菌株為食（圖1A）持續四個月，與對照喂養的魚相比，表現出強烈改變的行為模式。
使用Ethovision軟件，我們創建了兩個同構的虛擬子區域（圖1 B），目的是分析探索模式（行為的時空動態）。
我們的結果顯示，在新型水箱測試中，虛擬產生的游泳區域（上下）的偏好性有統計學顯著差異（p = 0.0137；t = 2.790）。益生菌喂養的動物在分析熱圖時表現出對上部區域的總體強烈偏好（圖 1）。C和1D）。
圖1 鼠李糖乳桿菌CECT8361和長雙歧桿菌CECT7347的攝入可調節4個月后斑馬魚的行為。（一）實驗設計的示意圖。（B）新型水箱試驗（NTT）和已建立的分析區域的示意圖。（C）在兩個實驗組（CONTROL和PROBIO）的軌跡進行Ethovision分析后獲得的熱圖。
另一方面，標準喂養的動物對表面沒有這種偏愛。實際上，與CTRL記錄的平均值（40±13.2％）相比，PROBIO組在較高區域中獲得的時間百分比的平均值（80±6.5％）。在對照組中，只有50％的受研究魚類表現出對上部區域的偏愛，而88.89％的益生菌喂養的動物更喜歡靠近水面。實際上，PROBIO組中的9條魚中有7條在上分區花費了80％的6分鐘新穎水箱測試實驗。
我們還評估了速度，每只動物的總游走距離（圖1 E），分區之間的過渡次數（圖1 F）和第一次穿越的潛伏期（圖1）。G）。統計分析僅記錄了平均速度（圖1 E）的顯著差異（p = 0.0158；t = 2.719 ）。
在我們的實驗中，與益生菌喂養的魚兄弟姐妹（4.2±0.3 cm / s）相比，CTRL顯示出更高的速度（6±0.5 cm / s）。進入PROBIO組的上部分區的潛伏期令人驚訝地低（直到第一次探索上部區域，沒有一條魚持續超過10 s）（圖1 H）。
鼠李糖乳桿菌CECT8361和長雙歧桿菌CECT7347的攝入可調節4個月后斑馬魚的行為。柱狀圖和點狀圖顯示：（D）動物在上部區域所花費的時間（％）；（E）平均速度（cm / s）; （F）總距離（厘米）；（G）過線點（n。）和（H）到第一個過境點的延遲時間。數據以平均值±標準誤差表示。星號顯示出統計學上的顯著差異*（p <0.050）。
這些數據令人關注，因為它們結合了明確的空間偏好；它們表明群體之間的行為模式存在明顯差異。壓力可以調節斑馬魚的NTT模式行為。一些通常用于治療人類焦慮癥的抗焦慮藥，例如丁螺環酮和地西epa或慢性氟西汀，往往會增加斑馬魚在實驗設備頂部花費的時間。
這些與我們的結果的相似性表明，益生菌混合物可能對模型動物的焦慮調節有影響。進一步的研究可以解決抗焦慮控制的納入和菌株定植的證明。但是，我們認為在4個月內持續進食可以確保腸道中細菌及其代謝物的持續存在。
總之，我們已經確定，鼠李糖乳桿菌CECT8361和長雙歧桿菌CECT7347的長期攝入（4個月）會改變斑馬魚模型中的游泳方式。我們的研究結果表明，成年斑馬魚飼喂這種已批準供人類食用的抗氧化劑和消炎益生菌菌株的益生菌混合物，可將其放置在新的水箱中，從而大大降低斑馬魚的底棲測地行為。這種主要的行為反應與較低的焦慮狀態相關。因此，攝入這種益生菌混合物可以被認為是治療焦慮癥的有益方法。
參考資料：
[1] Bass, S.L.S., Gerlai, R., 2008. Zebrafifish (Danio rerio) responds differentially to stimulusfifish: the effects of sympatric and allopatric predators and harmless fifish. Behav. BrainRes. 186 (1), 107–117.
[2] Bencan, Z., Sledge, D., Levin, E.D., 2009. Buspirone, chlordiazepoxide and diazepameffects in a zebrafifish model of anxiety. Pharmacol. Biochem. Behav. 94 (1), 75–80.
[3] Cachat, J., Stewart, A., Grossman, L., Gaikwad, S., Kadri, F., Chung, K.M., et al., 2010.Measuring behavioral and endocrine responses to novelty stress in adult zebrafifish.Nat. Protoc. 5 (11), 1786–1799.