隨著越來越多的神經系統疾病尚未被征服，對人類健康構成威脅，理解大腦的全部功能并能夠治療各種神經系統疾病是每位神經科學家致力于的方向。由于實際和倫理的限制，獲取實驗性腦組織是困難的，傳統上，某些嚙齒動物經常被用作神經科學研究的模型生物。然而，人類和嚙齒動物在腦組織結構和發展上的相似性并不是很高。因此，體外培養腦類器官是一個需要迫切解決的問題。

研究人員可以將人類多能干細胞（hPSCs），包括誘導多能干細胞（iPSCs）和胚胎干細胞（ES），分化為神經細胞，并在體外培養腦類器官以模擬人類環境。這有利于研究人員開發治療疾病的療法。

培養步驟

文獻1

研究團隊開發了一種方法，將人類多能干細胞分化為表達人類中腦特征標記的神經細胞層。他們將患者的皮膚成纖維細胞重新編程為iPSCs，然后將其在含有基礎FGF、CHIR-99021和MEK抑制劑（PD0325901）的培養基中培養。

神經誘導培養基（DMEM/F12）：Neurobasal、1:100 N2、1:50不含維生素A的B27、1%谷氨酰胺、10 μM SB-431542、200 ng/mL Noggin、0.8 μM CHIR-99021和10 μM ROCK抑制劑Y-27632、0.1% β-巰基乙醇、1 μg/mL肝素。在前48小時內添加了Y-27632，第二天更換了培養基。

三天后，hMLOs開始擠出神經外胚層芽。此時，完全移除培養基，并立即使用預冷的200 μL移液槍頭向每個孔中加入30 μL的低生長因子基質凝膠。嵌入基質中的中腦類器官被放置在37°C培養箱中30分鐘以固化基質。

組織生長誘導培養基包含Neurobasal培養基、1:100 N2、1:50不含維生素A的B27、1%谷氨酰胺、0.1% β-巰基乙醇、2.5 μg/mL胰島素、200 ng/mL層粘連蛋白、100 ng/mL SHH-C25II和100 ng/mL FGF8。

分化培養基由Neurobasal培養基、1:100 N2、1:50不含維生素A的B27、1%谷氨酰胺、100 μM抗壞血酸、125 μM DBcAMP、0.1% β-巰基乙醇、10 ng/mL BDNF和10 ng/mL GDNF組成。為了防止長期培養期間的潛在細菌污染，向培養基中添加了抗生素。每3天更換一次培養基。

Figure 1. Typical Morphology of Cells at Each Stage of Human Midbrain Organoids (SBNC: SB-431542, CHIR-99021, Noggin) [1]

Figure 2. Neuronal Immunostaining [1]

文獻2

額顳葉癡呆是一種高度致殘的神經系統疾病，以行為、語言和認知障礙為特征。已知tau蛋白的突變與此病密切相關，但具體涉及的機制尚未完全理解。因此，一個研究團隊利用人類誘導多能干細胞（iPSCs）構建了表達突變型tau蛋白的額顳葉癡呆的體外腦類器官模型，這些模型表現出大部分損傷。這使得研究者能夠闡明神經損傷早期的分子變化，解釋病理機制，并發現一種能夠抑制神經元死亡的藥物，Apilimod。

球狀體形成培養基（SFM）：由E8培養基和10 mM ROCK抑制劑Y-27632組成。

分化培養基：E6培養基補充了2.5 mM Dorsomorphin、10 mM SB-431542和2.5 mM XAV-939；每個球狀體加入1 mL培養基。輕輕混合球狀體并孵化在37°C、5%二氧化碳的環境中48小時。

每天，輕輕吸去培養皿中的培養基，并用分化培養基替換，從第2天到第5天實現65%的培養基交換。第6天，將培養基更換為神經培養基（NM），由神經基礎培養基、不含維生素A的B27、谷氨酸和抗A組成，補充了20 ng/mL EGF + 20 ng/mL FGF2。

從第25天開始，用20 ng/mL BDNF和20 ng/mL NT3（培養基C）補充NM，每隔一天補充65%的培養基。從第43天起，每3-4天更換一次培養基，不再添加生長因子，每個培養皿更換15-20 mL培養基，更換75%的培養基。在培養期間，使用一次性手術刀將融合的類器官分開。在下圖所示的實驗中，誘導多能干細胞被培養和成型。

Figure 3. Longitudinal Axis of Neuronal Survival in Brain Organoids [2]

Figure 4. Images of tau-V337M and wild-type V337V organoids treated with 5 mM glutamate [2]

Figure 5. Images of tau-V337M organoids treated with 5 mM glutamate salt and DMSO [2]

Figure 6. Reversal of Glutamate Excitotoxicity Sensitivity in tau-V337M Organoids by Apilimod [2]

文獻3

人類大腦發育表現出幾個獨特的方面，例如復雜性的增加和神經元輸出的擴展，這些已被證明在模型生物中研究是具有挑戰性的。因此，模仿人類大腦發育和疾病的體外方法已成為一個熱門研究領域。

在這里，一個研究團隊建立了一個腦類器官培養模型，該模型模仿內在的發育程序。這個模型可以在標準組織培養箱中培養，并在1-2個月內發育出皮質區域、前腦甚至視網膜組織。這種方法可以應用于發育研究以及各種人類大腦疾病的研究。

此外，由于類器官可以在培養中維持超過一年，它們也有可能模擬神經元成熟和存活等后期事件。

人類多能干細胞生成腦類器官：通過添加L-丙氨酰-L-谷氨酰胺溶液、ROCK抑制劑Y-27632、N-2補充劑、不含維生素A的B27、B27+vitA補充劑、青霉素-鏈霉素、bFGF等。[3]

Figure 7. Progression of Human PSC-Derived Brain Organoid Development [3]

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