2023年7月20日，中國藥科大學李萍/陳君研究團隊在Acta Pharmaceutica Sinica B（IF 14.5）發(fā)表題為“A high-throughput Gaussia luciferase reporter assay for screening potential gasdermin E activators against pancreatic cancer”的文章。研究首次報道了用于高通量篩選潛在抗PDAC的GSDME激活劑的hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)，揭示該系統(tǒng)在鑒定引發(fā)GSDME依賴性焦亡的化合物和開發(fā)有前景的PDAC治療藥物方面具有重要意義。
01 研究背景
胰腺導管腺癌（PDAC）是胰腺癌的主要類型，占胰腺癌的95%，預后極差且當前治療方法療效有限。研究發(fā)現(xiàn)，激活的蛋白酶caspase-3在gasdermin E（GSDME）缺乏的細胞中傾向于誘導細胞凋亡，而在GSDME充足的細胞中傾向于誘導細胞焦亡。據(jù)報道GSDME在大多數(shù)腫瘤細胞中是沉默的，但其在PDAC細胞中高表達，因而由GSDME介導的細胞焦亡可能是一種潛在的對抗PDAC的創(chuàng)新策略。
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基因信息
gasdermin E（介導細胞焦亡的GSDM蛋白家族成員）
實驗動物
PANC-1 GSDME WT細胞異種移植的小鼠模型
病毒產(chǎn)品
AAV-shGSDME、AAV-shC
注射方式
瘤內(nèi)注射兩次，每次間隔三天
病毒用量
5.0x1011vg/mouse
02研究方法與結(jié)果
1. hGLuc-hGSDME-PCA篩選系統(tǒng)的構(gòu)建和條件優(yōu)化
正常情況下，GSDME蛋白在細胞質(zhì)中不具有誘導細胞死亡的活性。然而，當特定刺激觸發(fā)caspase-3時，全長GSDME可以被caspase-3切割成GSDME-N和GSDME-C，隨后GSDME-N之間的相互作用促進了焦亡的發(fā)生。利用簡單靈敏的GLuc報告基因，作者構(gòu)建了hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)，尋找能夠特異性激活GSDME并導致焦亡的化合物。將臨床治療胰腺癌的多種化合物或已發(fā)表的焦亡誘導劑施用于PANC-1細胞，發(fā)現(xiàn)sorafenib表現(xiàn)出極好的焦亡誘導效果，并伴隨著細胞膜破裂和caspase-3裂解。隨后，作者在轉(zhuǎn)染試劑、DNA轉(zhuǎn)染量、DNA與轉(zhuǎn)染劑的比例、細胞接種密度等方面對hGLuc-hGSDME-PCA篩選系統(tǒng)進行了優(yōu)化。
hGLuc-hGSDME-PCA篩選系統(tǒng)的優(yōu)化
2. Ponatinib和perifosine抑制PDAC細胞的生長
作者利用hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)，對FDA批準的抗癌藥物文庫進行篩選，首次發(fā)現(xiàn)化合物ponatinib和perifosine可以誘導GSDME的裂解。進一步的分析數(shù)據(jù)表明ponatinib和perifosine處理均可顯著抑制PDAC細胞系活力，抑制作用具有劑量和時間依賴性。克隆形成實驗和EdU插入實驗證明ponatinib和perifosine抑制PANC-1細胞增殖并提高LDH釋放量。提示ponatinib和perifosine可能是抗PDAC的候選藥物。
Ponatinib和perifosine抑制PDAC細胞增殖，誘導細胞死亡
3. Ponatinib和perifosine通過caspase-3/GSDME途徑觸發(fā)PDAC細胞焦亡
Ponatinib和perifosine以劑量依賴性的方式誘導PDAC細胞中caspase-3和GSDME的裂解，同時胞內(nèi)GSDME傾向定位于細胞膜。免疫印跡實驗表明，與對照組相比，藥物治療后GSDME二聚體和寡聚體條帶明顯增加，證實ponatinib和perifosine不僅能誘導細胞內(nèi)GSDME的裂解，還能誘導GSDME的寡聚化；此外，PANC-1和BxPC-3細胞經(jīng)ponatinib或perifosine處理后直接進入annexin V和PI雙陽性階段，說明兩種化合物誘導的是焦亡而不是凋亡。進一步分析表明ponatinib和perifosine主要通過激活caspase-3/GSDME途徑引起PDAC細胞焦亡。
ponatinib和perifosine通過caspase-3/GSDME途徑觸發(fā)PDAC細胞焦亡
4. Perifosine和sorafenib抑制異種移植物腫瘤生長，誘導PDAC細胞焦亡
作者利用PANC-1異種移植腫瘤模型，以驗證perifosine在體內(nèi)的抗PDAC活性，結(jié)果表明perifosine以劑量依賴的方式減輕了PANC-1腫瘤負荷，并上調(diào)了caspase-3和GSDME的表達，免疫熒光圖像也證實perifosine提高了腫瘤組織細胞中cleaved caspase-3的蛋白水平。重要的是，作者首次發(fā)現(xiàn)sorafenib也通過焦亡對胰腺癌產(chǎn)生類似的抑制作用，表明perifosine和sorafenib可能通過誘導GSDME介導的焦亡來抑制PDAC腫瘤的體內(nèi)生長。最后，作者將AAV-shGSDME或AAV-shC注射到PANC-1 GSDME WT細胞形成的皮下腫瘤中，以降低腫瘤組織中GSDME的表達，結(jié)果顯示瘤內(nèi)敲低GSDME后，perifosine對PANC-1異種移植腫瘤生長的抑制作用大大減弱。此外，經(jīng)perifosine處理的AAV-shC組血清LDH水平、GSDME-N和cleaved caspase-3水平均顯著升高，并在敲低GSDME后得到逆轉(zhuǎn)。表明GSDME依賴性焦亡在perifosine治療PDAC中起關(guān)鍵作用。
Perifosine和sorafenib抑制異種移植物腫瘤生長，誘導PDAC細胞焦亡
03 小結(jié)
綜上所述，hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)是一種定量、高通量鑒定化療藥物致細胞焦亡活性的有力工具。基于該系統(tǒng)篩選出的抗癌藥物ponatinib和perifosine，通過caspase-3/GSDME途徑促進PDAC細胞的焦亡，從而抑制胰腺癌進展。研究結(jié)果強調(diào)了hGLuc-hGSDME-PCA系統(tǒng)在開發(fā)抗PDAC藥物中的重要性。