編者按
類器官(Organoid)作為新型實驗模型，較好地保留了其起源組織的形態表型、細胞功能、生物學行為以及基因譜特征。因其可體外培養、低溫保藏和復蘇再利用又有“活組織庫”(living biobank)之稱。類器官作為實驗動物的替代品在新藥研發及藥物敏感性篩選中擔當重要角色，其質量好壞直接影響到實驗精準性，故規范與制定類器官構建各環節的標準迫在眉睫。類器官構建領域存在兩大主流方向：成體干細胞(ASC)源性類器官（又稱患者源性類器，PDO）和誘導性多潛能干細胞(iPSC)/胚胎干細胞（ESC）源性類器官。
今天，我們分享一項由瑞金醫院普外科/上海消化外科研究所于穎彥教授、生物芯片上海國家工程研究中心郜恒駿教授團隊于2024年11月聯合發表在《Chinese Medical Journal》（IF=7.5，Q1）的成果，通過聚焦于成體干細胞源性類器官，系統地闡述類器官構建的規范性操作流程、類器官培養相關實驗室標準化建設、國內外已經出臺的類器官相關標準或指南性文件，并提出該領域存在的挑戰和未來發展方向。
文章題目
Living biobank: standardization of organoid construction and challenges
雜志：Chinese Medical Journal（IF=7.5，Q1）
發表時間：2024年12月5日
作者：楊蕊馨博士、郜恒駿教授、于穎彥教授等
單位：瑞金醫院普外科、上海消化外科研究所、生物芯片上海國家工程研究中心
01、研究背景
在生物醫藥領域，藥物研發、疾病診斷與治療以及致病機制的研究均離不開實驗模型。比如細胞系與實驗動物。前者在體外長期培養中歷經基因組變異壓力的選擇，已難以反映原始腫瘤的生物學行為和對藥物治療反應。故利用腫瘤細胞系開展的藥物篩選體外治療有效，但在后續臨床試驗中失敗的案例屢見不鮮。而實驗中常用的動物模型，比如免疫缺陷小鼠動物模型和人源性異種移植瘤模型，在疾病與腫瘤的發病機制研究、新型分子靶點鑒定以及臨床前治療藥物敏感性評價中可發揮一定作用，但因缺乏完整的免疫系統，與人類生長體系尚存在相當的差異。
2009年問世的類器官作為新型實驗模型，可以實現對多種組織細胞的體外培養、低溫保藏和復蘇后再利用，作為體外活組織庫受到生物醫藥界青睞。2022年底，美國FDA通過的一項新法案提出，新藥的臨床前研究可不再強制進行動物實驗，可采用類器官芯片或人工智能等新技術作為替代品，奠定了類器官這種新型實驗模型在新藥研發中的地位。隨著類器官在生物醫藥研究、臨床轉化研究應用范圍擴大，該領域中的技術標準制定與實施問題應運而生。
類器官構建的標準化是指對組織樣本前處理、3D細胞培養、類器官傳代、類器官凍存、類器官復蘇、類器官表型鑒定、類器官基因譜分析以及類器官質量評估等多環節進行規范化操作和管理，確保產出的類器官質量高且性能穩定。
我國標準化體系分成五個層級：國家標準、行業標準、地方標準、團體標準和企業標準。自2022年初首個《人胃腸上皮組織類器官的構建與保藏操作指南》團體標準（T/CMBA 017-2022）發布并實施以來，截止到2024年6月，國內外已經有多部類器官相關的團體標準及臨床診治指南問世，為不同組織細胞源性類器官構建及臨床應用提供了指導性文件。
類器官模型研發及標準化建設仍處于早期發展階段，多種組織細胞來源的標準及疾病模型尚處于空白。已經出臺的類器官相關標準主要為團體標準，尚未上升到國家標準層面。國際上也缺乏類器官構建統一的標準。此外，更加仿真的類器官構建技術還在研發階段，比如實體腫瘤類器官與腫瘤微環境細胞的共培養體系需要不斷完善，組織細胞類器官與病原微生物的共培養系統需要探索。
除了本文介紹的成體干細胞源性類器官外,iPSC/ESC源的類器官構建也需要進一步加強，從而解決某些罕見單基因遺傳性疾病等缺乏研究模型的問題。隨著人工智能自動化技術的發展，標準化類器官培養技術與人工智能相結合，可以促進類器官培養的自動化，提高質量評估的精準性與效率。標準化類器官培養技術與臨床大數據或基因組大數據相結合，有助于新藥研發及藥物敏感性精準預測。
02、研究成果
1. 類器官構建標準化
類器官構建的標準化，涵蓋組織樣本前處理、3D細胞培養、類器官傳代、凍存、復蘇、表型鑒定、基因譜分析以及質量評估等多個環節，旨在確保產出的類器官具備高質量和穩定性能，對推動類器官技術從實驗室研究走向臨床應用與產業化發展，具有重要的意義（圖1）。
圖1 類器官構建的關鍵步驟
1.1 組織收集與預處理
在組織收集和預處理階段，需嚴格遵循人類生物庫倫理要求。專業醫生需在30分鐘內對新鮮人體組織樣本進行處理，樣本大小不小于5×5mm，放入含抗生素的DMEM/F12保存液。若不能當日培養，需使用含Y27632的保存液過夜，并在24小時內開始類器官培養。預處理過程包括徹底清洗組織，用含抗生素的PBS洗滌，切割后振蕩洗滌、離心并丟棄渾濁液，重復洗滌三次。
1.2 類器官培養
類器官培養時，消化酶和時間需依據組織類型靈活調整。例如，胃腸道等組織需在37℃下用含膠原酶和透明質酸酶的消化液處理，胃腸道、食管和肺組織消化約1小時，肝臟30分鐘，腎臟15分鐘。消化后過濾、離心得到細胞球，加入DMEM/F12培養基與基質膠混合接種于孔板，37℃孵育后添加完全培養基培養，每3 - 5天換液，2周后可傳代。
1.3 類器官傳代
細胞培養兩周后進行類器官傳代，使用TrypLETM Express酶將類器官消化成單細胞，重懸于與Matrigel混合的高級DMEM/F12培養基中，按1:1比例接種于24孔板，傳代比例通常為1:2或1:4 ，代數少于10為早期，10-20代為中期，超過20代為后期。
1.4 類器官低溫貯藏與復蘇
為建立體外活生物庫，細胞傳代時約2/3細胞用于冷凍保存。將細胞與CryoStor® CS10冷凍液混合，置于-80°C冷凍盒過夜，次日轉移至液氮罐長期保存。類器官復蘇基于快速解凍原理，將冷凍管放入37°C水浴中搖晃加速融化，融化后轉移到離心管，加入DMEM/F12培養基離心，去除上清液保留沉淀，重懸于Matrigel混合培養基，按1:1比例接種于24孔板，37℃培養箱培養30分鐘后加入完全培養基繼續培養。
1.5 廢棄類器官處理
若類器官培養中基質或培養基3天內變混濁，可能是真菌或細菌污染，需丟棄；懷疑支原體污染時，可嘗試使用去除劑，無效則需丟棄，并按生物醫學廢物規定處理。
2. 類器官的分子特性及質量控制
類器官雖能保留親本組織的遺傳特征和生物學功能，但長期傳代、冷凍保存、復蘇和再培養對其分子特性的影響研究尚不充分。研究顯示，短期傳代類器官基因突變漂移率低，長期傳代則會顯著增加基因突變漂移率 ?？衫没蚪M學方法如WGS、WES、RNA-seq和scRNA-seq進行分子分析，通過核型分析和STR檢測鑒定類器官系。評估類器官質量的方法包括形態學觀察、多種染色技術和ATP含量檢測（圖2）。
圖2 類器官評價采用多種評價方法
3. 實驗室標準化建設
構建高質量類器官離不開完善的實驗室設施。在中國，根據實驗目的不同，細胞培養室通常分為三層結構（圖3）。
圖3 標準化細胞培養室的布局
3.1 基礎研究細胞培養室
需遵循《潔凈室設計規范》，環境潔凈等級至少滿足D+A級。實驗室內設備精簡，設有物料和樣品專用入口及特殊出口，研究人員通過換鞋、換衣和空氣淋浴的三層緩沖區進入。室內有嚴格的潔凈等級和細菌標準，溫度、濕度需控制，通風量需達標，所有操作在凈化工作臺上進行，工作人員需提前開啟空氣凈化系統和紫外線燈。
3.2 藥物開發細胞培養室
專為新藥篩選、藥敏試驗等設計，潔凈等級至少達到C+A級。C級標準對靜態和動態下粉塵顆粒數、浮游細菌和沉積物細菌標準，以及溫度、濕度和通風頻率都有明確規定。實驗操作在A級生物安全柜上進行，工作人員進入流程與基礎研究細胞培養室相同，且設有單獨出口避免交叉污染。
3.3 生產治療級生物藥品細胞培養室
根據《醫藥行業潔凈車間設計標準》，潔凈標準至少達到B+A級。B級潔凈區在靜態和動態條件下對粉塵顆粒數限制嚴格，浮游細菌和沉積物細菌標準更嚴苛，環境溫度和濕度也有具體要求。實驗操作在A級生物安全柜中進行，工作人員進入流程一致，設有單獨出口避免交叉污染，且細胞培養室需定期消毒（表1）。
表1
4. 國內外類器官相關標準現狀
我國標準化體系包含國家標準、行業標準、地方標準、團體標準和企業標準五個層級。自2022年初首個《人胃腸上皮組織類器官的構建與保藏操作指南》團體標準發布實施以來，截至2024年6月，國內外已出臺多部類器官相關團體標準及臨床診治指南，為不同組織細胞源性類器官構建及臨床應用提供了指導。但類器官模型研發及標準化建設仍處于早期，多種組織細胞來源的標準及疾病模型尚屬空白，已出臺標準多為團體標準，未上升到國家標準層面，國際上也缺乏統一標準（圖4）。
圖4 類器官相關標準或指南的時間表
03、類器官構建面臨的挑戰與未來方向
目前，類器官模型研發及標準化建設仍處于早期發展階段，多種組織細胞來源的標準及疾病模型尚處于空白。已經出臺的類器官相關標準主要為團體標準，尚未上升到國家標準層面。國際上也缺乏類器官構建統一的標準。
此外，更加仿真的類器官構建技術還在研發階段，比如實體腫瘤類器官與腫瘤微環境細胞的共培養體系需要不斷完善，組織細胞類器官與病原微生物的共培養系統需要探索。
除了本文介紹的成體干細胞源性類器官外，iPSC/ESC源的類器官構建也需要進一步加強，從而解決某些罕見單基因遺傳性疾病等缺乏研究模型問題。隨著人工智能自動化技術的發展，標準化類器官培養技術與人工智能相結合，可以促進類器官培養的自動化，提高質量評估的精準性與效率。標準化類器官培養技術與臨床大數據或基因組大數據相結合，有助于新藥研發及藥物敏感性精準預測。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！