編者按
類器官(Organoid)作為新型實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，較好地保留了其起源組織的形態(tài)表型、細(xì)胞功能、生物學(xué)行為以及基因譜特征。因其可體外培養(yǎng)、低溫保藏和復(fù)蘇再利用又有“活組織庫”(living biobank)之稱。類器官作為實(shí)驗(yàn)動物的替代品在新藥研發(fā)及藥物敏感性篩選中擔(dān)當(dāng)重要角色，其質(zhì)量好壞直接影響到實(shí)驗(yàn)精準(zhǔn)性，故規(guī)范與制定類器官構(gòu)建各環(huán)節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)迫在眉睫。類器官構(gòu)建領(lǐng)域存在兩大主流方向：成體干細(xì)胞(ASC)源性類器官（又稱患者源性類器，PDO）和誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞(iPSC)/胚胎干細(xì)胞（ESC）源性類器官。
今天，我們分享一項(xiàng)由瑞金醫(yī)院普外科/上海消化外科研究所于穎彥教授、生物芯片上海國家工程研究中心郜恒駿教授團(tuán)隊(duì)于2024年11月聯(lián)合發(fā)表在《Chinese Medical Journal》（IF=7.5，Q1）的成果，通過聚焦于成體干細(xì)胞源性類器官，系統(tǒng)地闡述類器官構(gòu)建的規(guī)范性操作流程、類器官培養(yǎng)相關(guān)實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)、國內(nèi)外已經(jīng)出臺的類器官相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或指南性文件，并提出該領(lǐng)域存在的挑戰(zhàn)和未來發(fā)展方向。
文章題目
Living biobank: standardization of organoid construction and challenges
雜志：Chinese Medical Journal（IF=7.5，Q1）
發(fā)表時間：2024年12月5日
作者：楊蕊馨博士、郜恒駿教授、于穎彥教授等
單位：瑞金醫(yī)院普外科、上海消化外科研究所、生物芯片上海國家工程研究中心
01、研究背景
在生物醫(yī)藥領(lǐng)域，藥物研發(fā)、疾病診斷與治療以及致病機(jī)制的研究均離不開實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?。比如?xì)胞系與實(shí)驗(yàn)動物。前者在體外長期培養(yǎng)中歷經(jīng)基因組變異壓力的選擇，已難以反映原始腫瘤的生物學(xué)行為和對藥物治療反應(yīng)。故利用腫瘤細(xì)胞系開展的藥物篩選體外治療有效，但在后續(xù)臨床試驗(yàn)中失敗的案例屢見不鮮。而實(shí)驗(yàn)中常用的動物模型，比如免疫缺陷小鼠動物模型和人源性異種移植瘤模型，在疾病與腫瘤的發(fā)病機(jī)制研究、新型分子靶點(diǎn)鑒定以及臨床前治療藥物敏感性評價中可發(fā)揮一定作用，但因缺乏完整的免疫系統(tǒng)，與人類生長體系尚存在相當(dāng)?shù)牟町悺?/span>
2009年問世的類器官作為新型實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，可以?shí)現(xiàn)對多種組織細(xì)胞的體外培養(yǎng)、低溫保藏和復(fù)蘇后再利用，作為體外活組織庫受到生物醫(yī)藥界青睞。2022年底，美國FDA通過的一項(xiàng)新法案提出，新藥的臨床前研究可不再強(qiáng)制進(jìn)行動物實(shí)驗(yàn)，可采用類器官芯片或人工智能等新技術(shù)作為替代品，奠定了類器官這種新型實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮谛滤幯邪l(fā)中的地位。隨著類器官在生物醫(yī)藥研究、臨床轉(zhuǎn)化研究應(yīng)用范圍擴(kuò)大，該領(lǐng)域中的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)制定與實(shí)施問題應(yīng)運(yùn)而生。
類器官構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化是指對組織樣本前處理、3D細(xì)胞培養(yǎng)、類器官傳代、類器官凍存、類器官復(fù)蘇、類器官表型鑒定、類器官基因譜分析以及類器官質(zhì)量評估等多環(huán)節(jié)進(jìn)行規(guī)范化操作和管理，確保產(chǎn)出的類器官質(zhì)量高且性能穩(wěn)定。
我國標(biāo)準(zhǔn)化體系分成五個層級：國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。自2022年初首個《人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)（T/CMBA 017-2022）發(fā)布并實(shí)施以來，截止到2024年6月，國內(nèi)外已經(jīng)有多部類器官相關(guān)的團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)及臨床診治指南問世，為不同組織細(xì)胞源性類器官構(gòu)建及臨床應(yīng)用提供了指導(dǎo)性文件。
類器官模型研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)仍處于早期發(fā)展階段，多種組織細(xì)胞來源的標(biāo)準(zhǔn)及疾病模型尚處于空白。已經(jīng)出臺的類器官相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)主要為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，尚未上升到國家標(biāo)準(zhǔn)層面。國際上也缺乏類器官構(gòu)建統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。此外，更加仿真的類器官構(gòu)建技術(shù)還在研發(fā)階段，比如實(shí)體腫瘤類器官與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的共培養(yǎng)體系需要不斷完善，組織細(xì)胞類器官與病原微生物的共培養(yǎng)系統(tǒng)需要探索。
除了本文介紹的成體干細(xì)胞源性類器官外,iPSC/ESC源的類器官構(gòu)建也需要進(jìn)一步加強(qiáng)，從而解決某些罕見單基因遺傳性疾病等缺乏研究模型的問題。隨著人工智能自動化技術(shù)的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)化類器官培養(yǎng)技術(shù)與人工智能相結(jié)合，可以促進(jìn)類器官培養(yǎng)的自動化，提高質(zhì)量評估的精準(zhǔn)性與效率。標(biāo)準(zhǔn)化類器官培養(yǎng)技術(shù)與臨床大數(shù)據(jù)或基因組大數(shù)據(jù)相結(jié)合，有助于新藥研發(fā)及藥物敏感性精準(zhǔn)預(yù)測。
02、研究成果
1. 類器官構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)化
類器官構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)化，涵蓋組織樣本前處理、3D細(xì)胞培養(yǎng)、類器官傳代、凍存、復(fù)蘇、表型鑒定、基因譜分析以及質(zhì)量評估等多個環(huán)節(jié)，旨在確保產(chǎn)出的類器官具備高質(zhì)量和穩(wěn)定性能，對推動類器官技術(shù)從實(shí)驗(yàn)室研究走向臨床應(yīng)用與產(chǎn)業(yè)化發(fā)展，具有重要的意義（圖1）。
圖1 類器官構(gòu)建的關(guān)鍵步驟
1.1 組織收集與預(yù)處理
在組織收集和預(yù)處理階段，需嚴(yán)格遵循人類生物庫倫理要求。專業(yè)醫(yī)生需在30分鐘內(nèi)對新鮮人體組織樣本進(jìn)行處理，樣本大小不小于5×5mm，放入含抗生素的DMEM/F12保存液。若不能當(dāng)日培養(yǎng)，需使用含Y27632的保存液過夜，并在24小時內(nèi)開始類器官培養(yǎng)。預(yù)處理過程包括徹底清洗組織，用含抗生素的PBS洗滌，切割后振蕩洗滌、離心并丟棄渾濁液，重復(fù)洗滌三次。
1.2 類器官培養(yǎng)
類器官培養(yǎng)時，消化酶和時間需依據(jù)組織類型靈活調(diào)整。例如，胃腸道等組織需在37℃下用含膠原酶和透明質(zhì)酸酶的消化液處理，胃腸道、食管和肺組織消化約1小時，肝臟30分鐘，腎臟15分鐘。消化后過濾、離心得到細(xì)胞球，加入DMEM/F12培養(yǎng)基與基質(zhì)膠混合接種于孔板，37℃孵育后添加完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，每3 - 5天換液，2周后可傳代。
1.3 類器官傳代
細(xì)胞培養(yǎng)兩周后進(jìn)行類器官傳代，使用TrypLETM Express酶將類器官消化成單細(xì)胞，重懸于與Matrigel混合的高級DMEM/F12培養(yǎng)基中，按1:1比例接種于24孔板，傳代比例通常為1:2或1:4 ，代數(shù)少于10為早期，10-20代為中期，超過20代為后期。
1.4 類器官低溫貯藏與復(fù)蘇
為建立體外活生物庫，細(xì)胞傳代時約2/3細(xì)胞用于冷凍保存。將細(xì)胞與CryoStor® CS10冷凍液混合，置于-80°C冷凍盒過夜，次日轉(zhuǎn)移至液氮罐長期保存。類器官復(fù)蘇基于快速解凍原理，將冷凍管放入37°C水浴中搖晃加速融化，融化后轉(zhuǎn)移到離心管，加入DMEM/F12培養(yǎng)基離心，去除上清液保留沉淀，重懸于Matrigel混合培養(yǎng)基，按1:1比例接種于24孔板，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)30分鐘后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
1.5 廢棄類器官處理
若類器官培養(yǎng)中基質(zhì)或培養(yǎng)基3天內(nèi)變混濁，可能是真菌或細(xì)菌污染，需丟棄；懷疑支原體污染時，可嘗試使用去除劑，無效則需丟棄，并按生物醫(yī)學(xué)廢物規(guī)定處理。
2. 類器官的分子特性及質(zhì)量控制
類器官雖能保留親本組織的遺傳特征和生物學(xué)功能，但長期傳代、冷凍保存、復(fù)蘇和再培養(yǎng)對其分子特性的影響研究尚不充分。研究顯示，短期傳代類器官基因突變漂移率低，長期傳代則會顯著增加基因突變漂移率 ?？衫没蚪M學(xué)方法如WGS、WES、RNA-seq和scRNA-seq進(jìn)行分子分析，通過核型分析和STR檢測鑒定類器官系。評估類器官質(zhì)量的方法包括形態(tài)學(xué)觀察、多種染色技術(shù)和ATP含量檢測（圖2）。
圖2 類器官評價采用多種評價方法
3. 實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)
構(gòu)建高質(zhì)量類器官離不開完善的實(shí)驗(yàn)室設(shè)施。在中國，根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康牟煌?，?xì)胞培養(yǎng)室通常分為三層結(jié)構(gòu)（圖3）。
圖3 標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞培養(yǎng)室的布局
3.1 基礎(chǔ)研究細(xì)胞培養(yǎng)室
需遵循《潔凈室設(shè)計(jì)規(guī)范》，環(huán)境潔凈等級至少滿足D+A級。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)設(shè)備精簡，設(shè)有物料和樣品專用入口及特殊出口，研究人員通過換鞋、換衣和空氣淋浴的三層緩沖區(qū)進(jìn)入。室內(nèi)有嚴(yán)格的潔凈等級和細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)，溫度、濕度需控制，通風(fēng)量需達(dá)標(biāo)，所有操作在凈化工作臺上進(jìn)行，工作人員需提前開啟空氣凈化系統(tǒng)和紫外線燈。
3.2 藥物開發(fā)細(xì)胞培養(yǎng)室
專為新藥篩選、藥敏試驗(yàn)等設(shè)計(jì)，潔凈等級至少達(dá)到C+A級。C級標(biāo)準(zhǔn)對靜態(tài)和動態(tài)下粉塵顆粒數(shù)、浮游細(xì)菌和沉積物細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)，以及溫度、濕度和通風(fēng)頻率都有明確規(guī)定。實(shí)驗(yàn)操作在A級生物安全柜上進(jìn)行，工作人員進(jìn)入流程與基礎(chǔ)研究細(xì)胞培養(yǎng)室相同，且設(shè)有單獨(dú)出口避免交叉污染。
3.3 生產(chǎn)治療級生物藥品細(xì)胞培養(yǎng)室
根據(jù)《醫(yī)藥行業(yè)潔凈車間設(shè)計(jì)標(biāo)準(zhǔn)》，潔凈標(biāo)準(zhǔn)至少達(dá)到B+A級。B級潔凈區(qū)在靜態(tài)和動態(tài)條件下對粉塵顆粒數(shù)限制嚴(yán)格，浮游細(xì)菌和沉積物細(xì)菌標(biāo)準(zhǔn)更嚴(yán)苛，環(huán)境溫度和濕度也有具體要求。實(shí)驗(yàn)操作在A級生物安全柜中進(jìn)行，工作人員進(jìn)入流程一致，設(shè)有單獨(dú)出口避免交叉污染，且細(xì)胞培養(yǎng)室需定期消毒（表1）。
表1
4. 國內(nèi)外類器官相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn)狀
我國標(biāo)準(zhǔn)化體系包含國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)、地方標(biāo)準(zhǔn)、團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)和企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)五個層級。自2022年初首個《人胃腸上皮組織類器官的構(gòu)建與保藏操作指南》團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)發(fā)布實(shí)施以來，截至2024年6月，國內(nèi)外已出臺多部類器官相關(guān)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)及臨床診治指南，為不同組織細(xì)胞源性類器官構(gòu)建及臨床應(yīng)用提供了指導(dǎo)。但類器官模型研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)仍處于早期，多種組織細(xì)胞來源的標(biāo)準(zhǔn)及疾病模型尚屬空白，已出臺標(biāo)準(zhǔn)多為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，未上升到國家標(biāo)準(zhǔn)層面，國際上也缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)（圖4）。
圖4 類器官相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)或指南的時間表
03、類器官構(gòu)建面臨的挑戰(zhàn)與未來方向
目前，類器官模型研發(fā)及標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)仍處于早期發(fā)展階段，多種組織細(xì)胞來源的標(biāo)準(zhǔn)及疾病模型尚處于空白。已經(jīng)出臺的類器官相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)主要為團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)，尚未上升到國家標(biāo)準(zhǔn)層面。國際上也缺乏類器官構(gòu)建統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)。
此外，更加仿真的類器官構(gòu)建技術(shù)還在研發(fā)階段，比如實(shí)體腫瘤類器官與腫瘤微環(huán)境細(xì)胞的共培養(yǎng)體系需要不斷完善，組織細(xì)胞類器官與病原微生物的共培養(yǎng)系統(tǒng)需要探索。
除了本文介紹的成體干細(xì)胞源性類器官外，iPSC/ESC源的類器官構(gòu)建也需要進(jìn)一步加強(qiáng)，從而解決某些罕見單基因遺傳性疾病等缺乏研究模型問題。隨著人工智能自動化技術(shù)的發(fā)展，標(biāo)準(zhǔn)化類器官培養(yǎng)技術(shù)與人工智能相結(jié)合，可以促進(jìn)類器官培養(yǎng)的自動化，提高質(zhì)量評估的精準(zhǔn)性與效率。標(biāo)準(zhǔn)化類器官培養(yǎng)技術(shù)與臨床大數(shù)據(jù)或基因組大數(shù)據(jù)相結(jié)合，有助于新藥研發(fā)及藥物敏感性精準(zhǔn)預(yù)測。
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