IF=15.328：浙大醫學院劉偉/Dante Neculai團隊合作揭示脂質轉移蛋白ORP8在脂滴自噬中的關鍵作用
脂質自噬是自噬小體選擇性吞噬脂滴( LDs )進行溶酶體降解，對脂質和能量穩態至關重要。自噬體對細胞器或蛋白質聚集體的選擇性吞噬需要吞噬體相關的LC3/GABARAP蛋白直接與特定的細胞器受體相互作用，或與細胞器相關的連接蛋白結合。目前已經發現許多類似受體可以指導線粒體、內質網(ER)和核糖體的包封。然而，特異性介導LDs識別和包裹的蛋白仍有待確定。
2022年12月，浙江大學醫學院劉偉教授研究團隊與Dante Neculai團隊合作在Protein & Cell（IF=15.328）上在線發表題為ORP8 acts as a lipophagy receptor to mediate lipid droplet turnover 的論文，研究發現脂質轉移蛋白ORP8是特異性的脂質自噬受體，通過能量感受激酶AMPK調節與LC3 / GABARAPs的相互作用介導脂滴（LDs）的自噬識別和降解，這些發現可能為脂代謝相關疾病的干預和治療提供新的靶點。
病毒產品 AAV9-ORP8-WT AAV9-ORP8-T54A/S65A AAV9-ORP8-LIRs-6A AAV9- ORP5 實驗動物 8周齡ob/ob小鼠 注射方式 腹腔注射 注射劑量 10E12VG 感染時間 4周
研究結果分享
1、ORP8促進LD降解
作者通過研究發現ORP8定位于LDs，且在誘導噬脂的條件下，ORP8的定位會增加。過表達ORP8會減少前脂肪細胞、小鼠肝臟和血漿中的甘油三酯（TGs），因此，作者進一步評估了ORP8在LD代謝中的潛在作用。敲低ORP8 而非ORP5 可顯著增加血清饑餓細胞的LD含量，隨后利用CRISPR-Cas9系統構建了ORP8敲除的Hela細胞，KO細胞給予OA治療或血清饑餓，通過測定LD標記物PLIN2和TG水平發現ORP8負向調節LD代謝。接下來，作者阻斷了LD的生物發生，分析ORP8-KO細胞中LD的降解，發現ORP8促進了LD的降解，而不依賴于脂肪分解。
圖1.ORP8促進LD降解 
2、ORP8可調節脂質自噬
作者進一步發現ORP8可以調節脂質自噬，ORP8在脂質自噬中的功能及其與LC3的相互作用強烈提示LD定位的ORP8可能作為靶向LD到自噬體的受體。為了驗證并闡明ORP8的功能機制，作者從OA處理的細胞中純化了LD，正如預期的那樣，膜結合LC3-II在WT細胞的LD上大量存在，但在ORP8-KO細胞的LD中含量極低。體外LD膜結合試驗發現，GFP-LC3招募了WT細胞的LD，而不是ORP8-KO細胞。進一步研究發現ORP8和LC3之間的相互作用，發現LD定位的ORP8與膜相關的LC3 / GABARAP直接發生相互作用，且該過程是吞噬體靶向LDs所必需的。
圖2.ORP8-LC3相互作用的特征
3、AMPK磷酸化并激活ORP8
AMPK激活非選擇性自噬響應能量缺乏，既往研究提示AMPK參與了脂質自噬，可能與其啟動自噬泡形成有關，此外，研究發現長鏈脂肪酸的輔酶A酯可變構激活肝細胞中主要表達的含β1亞基的AMPK。因此，作者研究了AMPK在ORP8介導的脂質自噬中的潛在作用。OA治療和血清饑餓都能激活HeLa細胞中的AMPK，有趣的是，在這些細胞中，ORP8也被磷酸化，血清饑餓刺激的ORP8磷酸化被AMPK抑制劑Compound C或AMPK α1/α2的KO所逆轉。此外，免疫共沉淀檢測到ORP8與AMPK之間的相互作用，血清饑餓促進了這種相互作用，Compound C消除了這種相互作用。此外，利用純化的ORP8和具有激酶活性的AMPK復合物進行體外激酶試驗，證實了ORP8是AMPK的直接底物。質譜法分析體外激酶試驗中磷酸化的ORP8，發現Thr54和Ser65是AMPK的兩個磷酸化位點，Thr54可能更為重要。接下來，作者確定了磷酸化對ORP8介導的脂質自噬的影響，AMPK通過直接磷酸化ORP8促進ORP8與LC3/GABARAP的相互作用，從而激活ORP8介導的噬脂作用。
圖3.AMPK磷酸化并激活ORP8
4、ORP8降低小鼠肝臟脂質沉積
最后，作者評估了ORP8介導的ob/ob小鼠噬脂的體內生理效應。作者觀察到禁食刺激了小鼠肝臟中ORP8蛋白和mRNA的表達，然后通過腹腔注射表達ORP8-WT、ORP8-T54A/S65A、ORP8-LIRs-6A或ORP5的rAAV9，注射4周后，僅AAV9-ORP8-WT組肝臟TG水平顯著降低，并減輕LD在肝臟中的積累。然而，這些注射均未顯著降低ob/ob小鼠的血漿TG水平，這可能反映了更復雜的血漿TG調節。 作者還利用CRISPR-Cas9介導的基因組工程構建了ORP8缺失的Osbpl8?/?小鼠。在正常飲食的Osbpl8?/?小鼠中，檢測到肝臟LDs和TG水平顯著增加；禁食24小時后，這些Osbpl8?/?小鼠表現出明顯的脂肪肝表型，肝臟LD進一步積聚，TG進一步升高。綜上所述，這些數據表明ORP8在體內LD分解代謝中起著重要作用。 圖4.ORP8減輕小鼠的脂質沉積
小結 該研究發現脂質轉移蛋白ORP8位于自噬體膜上，并介導自噬體膜對LDs的包裹，ORP8的這一功能獨立于其脂質轉運蛋白活性，通過與吞噬體錨定的LC3/GABARAPs直接相互作用實現。該研究揭示ORP8是一個在細胞脂質代謝中起關鍵作用的噬脂受體，在噬脂誘導過程中，ORP8增加了在LD上的定位，并被AMPK磷酸化，從而增強了其對LC3/GABARAPs的親和性。這些發現對深入理解LD自噬過程及其在細胞脂質代謝中的作用，以及脂肪肝等脂質代謝性疾病的發生機理等有重要意義。 · ·