腸道是人體中重要的消化器官，指的是從胃的幽門到肛門的消化道，是人體中最長的消化器官。人類腸道結構主要包括小腸和大腸。腸道疾病非常普遍，如腸梗阻、慢性炎癥性腸病、結直腸癌等，其中結直腸癌已成為威脅人類健康最嚴重的疾病之一。因此，腸道研究是一個非常熱門的領域，具有廣泛的應用前景。

培養流程-文獻分析1

2009年，由Hans Clevers領導的研究團隊首次成功地在體外培養了3D腸道“類器官”，使用的是單個干細胞（Lgr5+）或來源于腸道隱窩的單個隱窩結構。分離的腸道干細胞或隱窩能夠在基質凝膠、小分子化合物、細胞添加劑和各種生長因子的作用下持續增殖，具備自我更新和分化能力。它們可以分化為各種成熟的腸道細胞，并在建立和研究腸道疾病模型中發揮重要作用。[1]

Figure 1. Efficiency of Single-Cell Colony Formation in Single Wells

1. 隱窩分離，細胞分離，和細胞培養

通常通過在4°C下用含有2 mM EDTA的PBS孵育30分鐘，從小鼠小腸中釋放出隱窩。分離出的隱窩計數后形成球狀體。在24孔板中，加入基質凝膠和生長因子（10-50 ng/mL EGF、500 ng/mL R-spondin 1、100 ng/mL Noggin）進行孵化。

2. 細胞分選實驗

分離出的隱窩在37°C下孵育45分鐘，解離的細胞通過20微米細胞濾網。分選后的細胞收集在隱窩培養基中，并加入含有Jagged-1肽（1 μM）的基質凝膠中，每個孔一個細胞（96孔板中5 mL基質凝膠）。

3. 隱窩培養基

在48孔板中加入250 μL培養基，在96孔板中加入100 μL培養基，并補充小分子Y-27632（10 μM）。每隔一天添加生長因子，每4天更換一次培養基。

4. 傳代

將類器官從基質凝膠中取出，機械解離成單個隱窩結構，然后轉移到新鮮的基質凝膠中。傳代每1-2周進行一次，分比率為1:5。

Figure 2. Establishment of Intestinal Organoid Culture System [1] 

 Figure 3. b, c, d depict the situations after 5 days, 14 days, and 3 weeks of cultivation respectively, while e represents a schematic diagram of crypt-like organoids.

在培養小鼠結腸類器官時，培養基需要補充包括p38 MAPK激酶抑制劑（SB-202190）、TGF-β抑制劑（A 83-01）、Rho激酶抑制劑（Y-27632）、GSK抑制劑（CHIR-99021）、Jagged-1，以及生長因子如EGF、R-spondin-1、Noggin和Wnt-3A等小分子化合物。[1] [2]

研究團隊基于腸道上皮細胞的生長需求設計了這樣的培養系統。Wnt信號通路對隱窩增殖至關重要，Wnt激動劑R-spondin1在體內誘導顯著的隱窩增生。表皮生長因子（EGF）的信號傳導與腸道增殖相關，而Noggin的轉基因表達則誘導隱窩數量增加。Rho激酶抑制劑Y-27632抑制胚胎干細胞凋亡，降低細胞死亡率。細胞間的Notch信號對維持隱窩增殖至關重要，我們還提供了一種Notch激動肽（Jagged-1）。[1] [2]

文獻分析2

在2022年，Hans Clevers團隊創新性地引入了IL-22，以優化hSIOs培養基的成分，顯著提高了腸道類器官的出芽比例，并上調了Paneth細胞的表達水平，更好地模擬了人類腸道的組成表達成分，如下圖所示。

Figure 4. Cultivation of human colon (effects of small molecules Nicotinamide, SB 202190, and A 83-01 on cultivation)

Figure 5. Cultivation process of human colon adenocarcinoma cells

文獻分析3

用于類器官培養和hSIOs藥物刺激的培養基所需的小分子化合物、添加劑和細胞因子包括：B-27（1%）、N-乙酰半胱氨酸（1 mM）、煙酰胺（10 mM）、Alk 4/5/7抑制劑A 83-01（500 nM）、p38抑制劑SB 202190（3-10 μM）、前列腺素E2（10 nM）、CHIR-99021（3-10 μM）、Rho激酶抑制劑Y-27632二鹽酸鹽（10 μM）和Primocin（100 μg/mL）、BP-1-102、LY294002、MK-2206、雷帕霉素、N-2、谷氨酰胺、HEPES、青霉素/鏈霉素、R-Spondin、Noggin（2%）、人EGF（50 ng/mL）、人IL-22（2 ng/mL），如圖6中特別說明。[3]

人腸道類器官培養步驟

1、重新配制隱窩基質凝膠混合物，并在孔板中加入一定量的混合物和腸道類器官培養基（例如，對于24孔板，加入50 μL混合物和500 μL培養基）。

2、轉移到層流罩下，用含有抗生素的PBS沖洗2-3次，將腸道粘膜轉移到含有EDTA（2 mM）的溶液中，并在4°C下孵育大約30分鐘進行小腸消化，大約1小時進行結腸消化。

3、將消化后的小腸粘膜轉移到離心管中，加入PBS，充分搖勻，通過70 μm細胞濾網過濾，室溫下以1000轉每分鐘的速度離心5分鐘。結腸隱窩不需要過濾。

4、倒掉上清液，加入培養基重新懸浮沉淀物，計算隱窩數量，最佳數量約為每10 μL約10個隱窩。

5、將一定量的懸浮液加入離心管中，并在室溫下離心5分鐘。

6、加入預冷的基質凝膠混合物（基質凝膠：培養基 = 2:1）重新懸浮沉淀物。

7、根據一定量在預熱的孔板中接種重新懸浮的沉淀物。

8、每個孔中加入一定量的預熱的類器官培養基，并在37°C下培養1-2周。

人類腸道類器官傳代：

9、 在培養板的每個孔中加入一定量的培養基，小心使用移液管尖端刮出基質凝膠，收集懸浮液，并轉移到離心管中。

10、將需要傳代的類器官放在冰上5-10分鐘。

11、使用移液管尖端輕輕抽吸并破壞基質凝膠，重復該過程直到基質凝膠破碎，盡量避免氣泡的產生。

12、將消化后的小腸粘膜轉移到離心管中，加入PBS，充分搖勻，通過70 μm細胞濾網過濾，室溫下以1000轉每分鐘的速度離心5分鐘。結腸隱窩不需要過濾。

13、倒掉上清液，加入培養基重新懸浮沉淀物，計算隱窩數量，最佳數量約為每10 μL約10個隱窩。

14、將一定量的懸浮液加入離心管中，并在室溫下離心5分鐘。

15、加入預冷的基質凝膠混合物（基質凝膠：培養基 = 2:1）重新懸浮沉淀物。

16、傳代可以在1:1到3:1的比例之間進行。

人類腸道類器官冷凍保存：

17、 將需要冷凍的類器官放在冰上5-10分鐘。

18、收集類器官，離心后倒掉上清液。

19、加入冷凍介質重新懸浮類器官，分裝到冷凍管中，并存儲在-80°C。24小時后，轉移到液氮中長期保存。

使用腸道類器官建立體外腸道模型極大地促進了腸道疾病發生和發展的研究。它為高通量藥物篩選、新藥開發、藥物功能測試、靶向治療、個性化精準醫療和再生醫學提供了新的和重要的研究平臺和方法。腸道類器官的出現為腸道疾病研究和治療開辟了新的途徑。