凋亡，也稱為程序性細胞死亡，是一種由特定基因調控的有序或程序化的細胞死亡過程。它是細胞的一種主動死亡過程，也是細胞的正常生理反應。凋亡細胞最終會被體內的吞噬細胞處理。過度凋亡會直接導致組織和器官功能的下降；而對于癌細胞而言，凋亡過程的中斷則意味著癌癥的發展和擴散。

細胞形態變化

細胞凋亡的形態變化通常可以分為三個階段。第一階段涉及細胞間接觸的消失，但細胞膜仍然完整。核糖體從粗面內質網脫落，細胞核出現凝聚的跡象。這個階段持續時間非常短暫。第二階段涉及細胞核的碎裂，碎裂的細胞核與細胞內的各種細胞器結合，并被細胞膜進一步包裹形成凋亡小體。第三階段涉及吞噬細胞吞噬凋亡小體并將其消化，以便被生物體重新利用。

細胞凋亡的機制

(1) 死亡受體途徑及其調控：Fas/Fas配體（FasL）死亡途徑；腫瘤壞死因子受體（TNFR）死亡途徑。

(2) 線粒體途徑及其調控。

(3) 內質網途徑：CHOP途徑；c-Jun N端激酶（JNK）途徑；Caspase 12途徑。

(4) 細胞凋亡的端粒酶途徑。

(5) 一氧化氮（NO）參與的細胞凋亡反應。

檢測細胞凋亡的常見方法包括以下

1. 形態學檢測
正在經歷凋亡的細胞會表現出特定的形態學特征。最常用的形態學檢測方法包括熒光共聚焦激光掃描顯微鏡和透射電子顯微鏡。前者允許特定的染料（如Hoechst 33342、Hoechst 33258、DAPI）對細胞進行染色。這些染料在紫外線激發下，通過非插入式結合到DNA的A-T堿基區域，發出明亮的藍色熒光。

凋亡HeLa細胞DAPI染色中核染色體形態的變化

在凋亡過程中，HeLa細胞的細胞核會發生形態變化。與此同時，凋亡細胞體積縮小，細胞質變得更加濃縮。在凋亡的早期階段（前凋亡核），細胞核內的染色體高度凝聚，并呈現出許多類似空泡的結構，稱為空泡化。在中期階段（Ⅱa期），細胞核內的染色體高度凝聚并邊緣化。在凋亡的晚期，細胞核碎裂成較小的片段，形成凋亡小體。在電子顯微鏡下，凋亡細胞顯示出體積減小，表面微絨毛消失，細胞質濃縮。

電子顯微鏡下凋亡Jurkat細胞核染色體的形態變化

2. 檢測早期凋亡最常用的方法是Annexin V/PI雙染實驗。
在正常細胞膜中，磷脂的分布是不對稱的，磷脂酰絲氨酸（PS）位于細胞膜的內側。在細胞凋亡過程中，細胞膜發生變化，導致PS從內側翻轉到細胞膜的外側。Annexin V是一種依賴于鈣的磷脂結合蛋白，對PS具有很強的親和力。Annexin V能夠特異性識別凋亡細胞表面的PS，因為活細胞中的PS位于細胞膜的內側，不能特異性結合Annexin V。因此，可以使用FITC標記的Annexin V來區分凋亡細胞和活細胞。

壞死細胞的PS也會從內側翻轉到細胞膜的外側，Annexin V也能識別壞死細胞表面的PS。因此，Annexin V無法區分壞死細胞和凋亡細胞。然而，碘化丙啶（PI）染料可以結合細胞內的DNA，區分壞死細胞和活細胞。在早期凋亡細胞和活細胞中，細胞膜保持完整，阻止PI染料自由通過細胞膜結合到細胞內的DNA。因此，PI染料不能標記凋亡細胞和活細胞。PI染料卻能夠通過壞死細胞的細胞膜并結合到細胞內的DNA。當壞死細胞內的PI染料被488nm激光激發時，會發出紅色熒光，由相應的通道檢測。因此，通過同時使用Annexin V和PI，可以區分活細胞、早期凋亡細胞和壞死細胞。

3. 細胞凋亡 - 線粒體膜電位的檢測

JC-1是一種親脂性陽離子熒光染料，能夠與線粒體基質結合。其熒光強度的增強或減弱表明線粒體膜的電子親和力增加或減少。在正常的生理條件下，線粒體帶有高度的負電荷，JC-1以聚集體的形式進入線粒體，強烈地發出紅色熒光。在細胞凋亡過程中，線粒體發生去極化，導致負電荷減少。因此，JC-1在細胞質中以單體形式存在，導致綠色熒光增強

4. 細胞凋亡 - 活化Caspase-3的檢測

Caspase家族在介導細胞凋亡過程中發揮著至關重要的作用，其中Caspase-3是一個關鍵的執行分子，它在許多凋亡信號傳導途徑中起作用。Caspase-3通常以酶原（32 KD）的形式存在于細胞質中。在凋亡的早期階段，它被激活?；罨腃aspase-3由兩個大亞基（17 KD）和兩個小亞基（12 KD）組成，能夠裂解相應的細胞質和核內底物，最終導致細胞凋亡。然而，在凋亡的晚期和死亡細胞中，Caspase-3的活性顯著下降。

活化的Caspase-3由其前體裂解形成17KD的亞基和12KD的亞基，形成異二聚體，可以被特異性的抗活化Caspase-3抗體識別。通過使用熒光素標記的抗活化Caspase-3抗體，可以檢測活化的Caspase-3。

5. 細胞凋亡 - DNA碎片化的檢測

在細胞凋亡過程中，染色質凝聚，染色質內的DNA在核小體單位之間的連接處斷裂，形成180~200bp及其倍數的寡核苷酸片段。一旦DNA碎片化發生，在DNA雙鏈結構上就會出現許多缺口。在酶的作用下，FITC標記的dUTP或BrdU可以嵌入到這些缺口中，然后可以檢測嵌入信號的強度，以確定碎片化的程度。

6. TUNEL檢測方法
此外，檢測DNA碎片化的另一種方法是TUNEL（末端脫氧核糖核酸轉移酶dUTP缺口末端標記）檢測方法。在細胞凋亡過程中，DNA雙鏈或單鏈的斷裂產生大量粘性的3'-OH末端。利用這一線索，在末端脫氧核糖核酸轉移酶（TdT）的幫助下，生物素/熒光素標記的dUTP成功地結合到3'-OH末端。通過酶聯比色法或熒光檢測，可以對結果進行定量分析。

總之，細胞凋亡是由凋亡途徑中的各種分子促進的，僅憑單一指標的檢測很難輕易確定凋亡的發生。畢竟，在細胞凋亡的事件中，每個指標只維持一定的時間。因此，建議研究人員廣撒網，最好在不同的時間點使用多個指標來確認凋亡的發生。最后，為了避免假陽性和假陰性，設置陽性和陰性對照至關重要，以確保檢測結果的準確性。

相關產品