?一、?AAV 載體概述

? ?腺相關病毒(AAV)是一種無包膜的單鏈 DNA 病毒，是細小病毒家族的一員，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能進行自我復制。在沒有輔助病毒的情況下，

? ?AAV 可在哺乳動物細胞中長期潛伏?，F階段已發現的 AAV 有 12 種的血清型（AAV1 至AAV12）和 130 多種突變型[1] 。不同 AAV 血清型具有不同的衣殼蛋白空間結構、序列 和組織特異性，因而其識別與結合的細胞表面受體也相應有很大差別[2]，這也導致不同 血清型轉染的細胞類型和感染效率也各不相同。在基因治療中，將攜帶有外源基因的重組 腺相關病毒定點整合到宿主基因組，既能克服隨機插入所導致的染色體缺失和基因重排等 潛在危險，又可以達到長期治療的目的。

? ? ? 野生型 AAV 基因組編碼兩大開放閱讀框架(open reading frames，ORF) rep 和 cap，它們位于兩側的末端倒轉重復序列(interted teminal repeats，ITRs)之間。在 維真生物 的 AAV 病毒基因傳遞系統中，只有 ITRs 是復制和包裝所必需的順式元件，rep 和 cap 基因從病毒載體中被轉移到輔助質粒 AAV rep/cap Vector 中，轉移后空出的位置 是允許外源基因插入病毒基因組中的較大限度。在輔助質粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 的幫助下，僅需兩端的 ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進入腺相關病毒 顆粒。

? ? ? 重組腺相關病毒是基因傳遞和表達的一個重要工具[3]，其具有廣泛的宿主范圍及 組織感染能力，既能感染分裂細胞，也能轉導外源基因進入非分裂細胞，長期表達外源基 因，而不依賴于宿主細胞活躍的分裂能力。維真生物的 AAV 病毒基因傳遞系統 中，包含末端重復序列(ITRs)的載體質粒 pAV-FH AAV 載體與包含 rep/cap 基因的輔助質 粒 pAAV-rep/cap 載體沒有任何共同區域，避免通過重組而恢復出野生型病毒，宿主細胞 免疫反應被降至較低，從而允許對具有免疫能力的宿主細胞進行基因傳遞。我們的 AAV 病 毒基因傳遞系統可以生產出重組病毒滴度≥1011 病毒顆粒/毫升的病毒，濃縮后滴度可高達 1014 病毒顆粒/毫升，可以較大程度保證在動物細胞中的基因傳遞。rAAV 進入細胞 后，作為附加的 DNA 能穩定存在。基因的表達通常在第 2?7 天出現峰值，并可在體內持續數周甚至數月。

二、 腺相關病毒基因傳遞和表達的優勢

1.宿主范圍廣：隨時可轉染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂細胞；

2.多種血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等

3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分別由獨立的質粒表達；未發現 AAV 對人體致 病，rAAV 去除了 wtAAV 基因組的 96%，進一步保證了安全性；

4.免疫原性低：AAV2 的基因組僅 4681 個核苷酸，便于用常規的重組 DNA 技術進行操 作，而且進行動物實驗時造成的免疫反應

小。

三、 維真生物腺相關病毒的優勢

1）載體全：不同的啟動子（神經特異性啟動子 Human Synapsin、CamkIIα、GFAP 等）和多種報告基因（EGFP、mCherry、RFP 和 luciferase 等）可供客戶選擇；

2) 貨期短：AAV 克隆載體均與我們 18,000 個預制人類全長 cDNA ORF 克隆載體 MCS 區 通用，行業中短的生產周期2-3即可發貨；

3）滴度高：可提供 1012V.G/ml 及以上滴度的病毒.，可高達 1014V.G/ml；

4）服務優：可根據客戶的具體需求提供特殊定制服務。

四、 維真生物rAAV產品簡介

? ? 維真生物 獨有的**技術和創新性的 rAAV 載體和完善的 AAV 表達系統，可用于體內和體外表達 shRNA，human ORF 和 CRISPR，具有穩定可靠、重復性好、純度高、滴度 高的優點。

? ? ? AAV無輔助病毒系統（AAV Helper-Free System）可以在無輔助病毒的條件下生產出 重組人腺相關病毒。這種系統利用已經明確與調節AAV 復制和表達的腺病毒基因產物，并 且將這些基因產物通過轉染引進宿主細胞。重組腺相關病毒（rAAV）由多個質粒（Cis質 粒、輔助質粒、Rep/Cap質粒）組成。生產具感染性的AAV 病毒顆粒所需的腺病毒基因產 物（例如：E2A,E4 和VA RNA 基因）大部分由與其他質粒共轉染進細胞的pHelper 質粒提 供，其余的腺病毒基因產物由穩定表達腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主細胞提供。Rep 和 Cap 基因從病毒載體中被轉移到輔助質粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒載體中，實 際上在輔助質粒的幫助下，僅需兩端的ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進入腺相關病毒顆 粒，Rep 和Cap 基因的轉移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的較大限度。 Cis質粒、輔助質粒與Rep/Cap質粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有 復制的能力。維真生物的腺相關病毒載體ITR序列Rep/Cap基因分別由獨立的質粒表達,具 有高度安全性。

rAAV進入細胞和轉運的過程

1.rAAV 載體

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? ? ? 維真生物為您提供了多種腺相關病毒載體。包裝 AAV 無需輔助腺病毒，非致病 性、免疫原性低。AAV 包裝系統包括輔助質粒和 Rep/Cap 質粒，ITR 序列和 rep/cap 基 因分別位于獨立的質粒，安全性高。多種血清型 (AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9)可供選擇。根據不同客戶的需要，提供了分別適用于 human ORF、shRNA 和 CRISPR 、TALEN 基因組靶向操作服務的 AAV 載體。

2.rAAV 克隆服務

? 2.1 rAAV Human ORF 克隆服務

? ? ?維真生物 為 human ORF 克隆設計的 pAV-FH AAV 載體，具有 Amp 抗性、CMV 啟動子，帶有 Flag-His 標簽。多克隆位點與維真生物的 human ORF 穿梭克隆 相兼容。非常適于哺乳動物 ORF 的表達。

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? ? ? 2.2 rAAV shRNA 克隆服務

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? ? ? 維真生物 為您提供了多種表達 shRNA 的 rAAV，包括 U6 或 H1 啟動子和作為哺乳動物 表達標記的 GFP 或 RFP。同時，也可根據您感興趣的基因提供 shRNA 設計服務。

2.3 rAAV載體容量

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腺相關病毒載體能夠感染分裂和非分裂細胞。毒性和免疫原性低，適合以相對較高的 轉染效率在非分裂細胞中長期表達和在分裂細胞中短期表達基因。但AAV載體的外源基因 容納量有限，兩個ITR之間的空間只有4.7kb，因此可插入的外源基因為3.5kb甚至更小。 請參閱本表選擇適合您的病毒載體系統。

五、腺相關病毒顆粒生產流程

? ? ? 第一步：基因克隆。將外源基因克隆進入 維真生物公司的人源或 shRNA 腺相關病毒載 體，pAV-FH AAV 等載體的多克隆位點與我們的 human ORF 穿梭克隆相兼容，非常適于哺

乳動物 ORF 的表達。

? ? ? 第二步：細胞轉染。將攜帶外源基因的重組質粒與輔助質粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 共轉染進入 HEK293T 細胞，感染 72h 之后即包裝完畢。

? ? ? 第三步：收毒。分別收獲培養基上清與細胞沉淀，PEG8000 沉淀培養基上清中的病毒，培養 基上清先用 0.45um 濾膜過濾。

? ? ? 第四步：病毒純化。通過碘克沙醇法對病毒進行純化，一方面提高病毒滴度，另一方面某些 動物實驗需要純化之后才可進行。

? ? ? 第五步：滴度檢測。用 QPCR 的方法來檢測病毒的滴度，得到的結果為包裝得到的病毒顆粒數。

?

? ? ? 維真生物 的 pAV-FH AAV 載體，具有 Amp 抗性、CMV 啟動子，帶有 Flag-His 標簽。多克隆 位點與 維真生物 的 human ORF 穿梭克隆相兼容。非常適于哺乳動物 ORF 的表達。維真生物 為您提供了多種表達 shRNA 的 rAAV，包括 U6 或 H1 啟動子和作為哺乳動物表達標記的 GFP 或 RFP。同時，也可根據您感興趣的基因提供 shRNA 設計服務。

? ? ? pAAV-rep/cap 質粒（圖）包含 AAV 編碼復制蛋白和病毒衣殼蛋白的 rep 和 cap 基因，獲得 期望的高滴度病毒產品的關鍵基因。

pHelper 質粒（圖）包含 AAV-HEK293T 生產高滴度病毒必須的的腺病毒基因 VA，E2A 和 E4的集合。提供 AAV 生產所必需的腺病毒蛋白質 E1A 和 E1B 在 HEK293T 細胞中穩定表達。

生產流程示意圖

1.腺相關病毒重組克隆構建

? ? 1）根據訂單不同選擇不同的載體，在此以人源基因克隆為例。

? ? 2）維真生物公司的 AAV 載體與我們的人源 ORF 庫中的穿梭質粒的多克隆位點相兼容，通過酶 切，連接，轉化的方式將基因亞克隆進入 pAV-FH AAV 載體，得到陽性克隆之后進行酶切跑膠驗 證及測序以確認插曲片段的正確性。

2.細胞凍存流程

? ??1)按照培養細胞流程，將細胞吹下來加入 50ml 離心管中， 800g 離心 5min。

? ? 2)配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。

? ? 3)離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細胞吹勻

? ??4)取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 細胞凍存管中，做好標記和日期。

? ? 5)放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80 度冰箱過夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室 溫，使異丙醇的溫度達到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線上）。

? ? 6)第二天將凍存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

3.細胞復蘇流程

?

? ??1)10cm 培養盤中加 10cm 新鮮 DMEM 培養基，放培養箱預熱至 37℃。

? ? 2)從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1-2 分鐘左右）。

? ? 3)待細胞凍存管中溶液尚未完全融化時加入預熱的培養盤中。

? ?4)搖晃均勻，放培養箱培養。

? ? 5)4h 后待細胞完全貼壁后更換新鮮培養基（除去凍存液中 DMSO 對細胞的毒害作用。也可在第 3步中 800g 離心 5min，除去培養基后再懸浮細胞添加至新鮮預熱的 DMEM 細胞培養皿中）。

4.細胞培養流程（以 10cm 細胞培養皿，傳代為例）

? ??1)生物安全柜紫外滅菌半小時。

? ? 2)滅菌期間，DMEM 培養基(含 10%FBS，1%青鏈霉素混合液)、PBS 以及 0.25%胰酶在 37℃水浴鍋中預熱。

? ? 3)取匯合度接近 100%活性好的的 HEK293T 細胞，吸棄培養盤中培養基，加約 5ml，1×PBS，搖晃幾下，吸棄 PBS。（加 PBS 目的主要除去殘留在皿中的培養基中的 FBS，以提 高胰酶的消化效率）

? ??4)加 1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜內消化約 1min，室溫低時可放置于培養箱中消化。消 化時間不宜過長，否則影響細胞再次貼壁效率和活性。

? ? 5)加入約 5ml 的預熱的培養基。

? ? 6)用移液管吹打均勻，按照 1:3 比例傳代。各洗 2ml 培養基至新的 10cm 皿中，再加入8ml 預熱的 DMEM 培養基。（吹打過程中不可用力過大，否則會吹破細胞）。

? ? 注意：傳代盤數較多時，要先將預熱的 DMEM 培養基加入到 10cm 皿中，再加入含細胞的培 養基，以避免細胞分布不均。放置于培養箱前輕輕混勻皿中的培養基，使細胞均勻分散于 培養基中。細胞培養條件為 5%-7%CO2 濃度，37℃，培養箱內無菌水盤內水份提供一定的 濕度。細胞傳盤以及分 6 孔板，24 孔板，96 孔板分細胞都經過上述流程，只是細胞數與分的比 例不同，具體情況具體操作。

5.AAV 病毒包裝

?

? ??以 10cm 細胞培養皿為例

? ? 第一天: 聚合度 90%以上的 HEK293T 細胞按 1：3 比例傳盤（每盤大約 2.5 x 106），培 養基 Hyclone 高糖 DMEM 培養基（含 10%FBS）。

? ? 第二天: 轉質粒前 1-2h 左右，換成無血清培養基（所有血清型 AAV），用轉染試劑將目 的基因質粒和輔助質粒（需用酚氯仿提取的質粒）轉入 HEK293T 中。

? ??第三天：質粒轉化 24h 后，換新的無血清培養基（所有血清型 AAV）

? ? 第五天：轉染 72h 收毒。帶著培養基，吹下細胞，離心；然后分別收獲培養基上清與細胞 沉淀。用 PEG8000 沉淀培養基上清中的病毒，沉淀過夜后收集病毒沉淀。

6.AAV 病毒純化

? ??1)收集病毒沉淀和細胞沉淀。

? ? 2)細胞沉淀-80℃保存，后續實驗用。

? ? 3)破碎細胞。

? ??4) 將病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度離心進行純化。

7.病毒濃縮

? ? 用超濾管進行濃縮。

8.病毒滴度檢驗

? ? ?1)腺性相關病毒處理破除 AAV 病毒外殼 ，37 ℃ 孵育 30 min，然后加熱 95 ℃5 min 使 酶失活，體系如下：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?組成成分 ? ? ? ? ? ? ? 體積

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 病毒液 ? ? ? ? ? ? ? ??5ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?蛋白酶 K（5ug/ul） ? ?1ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 超純水 ? ? ? ? ? ? ? 4ul

? ? 2)離心 12000rpm,2min.取上清。

? ? 3)標準品的拷貝數，7 個梯度稀釋濃度分別：

? ??7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V. G./UL,7.2E+2V.G./UL.并將超純水作為陰性對照。

? ? 4)配制 PCR 反應體系，每個樣品 20 ul 體系，體系如下：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?組成成分 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?體積

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2X SYBRGreen 緩沖液? ? ? ? ? ? ? ?10ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??F、R 引物混合物 ? ? ? ? ? ? ? ? ??0.8ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??超純水 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??7.2ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?病毒樣品或標準品 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2ul

? ? ?5)PCR 反應體系

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

95℃ ?? ? ?5min；

95℃ ? ? ? ? 15sec

60℃ ? ? ? ? 15sec

72℃ ? ? ? ?15sec

40 個 ? ? ??cycles

? ? 6)病毒顆粒數公式：病毒顆粒數（個/ml）= 與標準品相對值 × 1000

六、 腺相關病毒感染目的細胞預實驗

?

? ? ? 以 2 型 AAV 病毒為例，維真生物為您推薦的 MOI 值 10000:1-100000:1，是根HEK293T 細胞得出的數據，不同的細胞所使用的病毒 MOI 值會有所不同。建議您感染目的 細胞前，進行預實驗摸索最佳 MOI 值，推薦使用有熒光的對照病毒來摸索條件。

? ? 1. 為了節省病毒，推薦使用 96 孔板進行預實驗。

? ? 2. 將目的細胞接種于 96 孔板中，細胞融合率為 50%為最佳。為保證細胞生長良好，請保 證細胞貼壁過夜。

? ??3. 取 10ul AAV 病毒原液加入 90 ul 培養基中做 1:100 稀釋（10-2），以此為起點做梯度 稀釋直至稀釋 10-7。可根據實際情況降低或提高稀釋倍數。

? ?4. 取出提前準備好的 96 孔板，先確定細胞生長狀況是否良好。用準備好的病毒稀釋液替 代舊培養基，注意保留未加入病毒的細胞孔作為對照組。

? ?5. 在加入病毒稀釋液后，請在 12-24h 后觀察細胞狀態來確認加入的病毒量是否合適，是 否因為加入的病毒量影響細胞狀態。如果細胞沒有變化，即所加病毒對細胞沒有毒性，可 以繼續培養。

? ?6. AAV 病毒對細胞的感染較慢，請在感染細胞后每天觀察細胞中熒光表達情況。 (成功 案例: 山大醫院學生利用我司提供的 AAV 病毒感染 jurkat，ca46 細胞,在 MOI 值 105 時,一個星期后看到熒光表達,并且成功通過 WB 檢測到目的基因的表達)（如果您選擇的產

品帶有 GFP 標簽，如果沒有熒光標簽請選擇在 96 小時以后的不同時間段分別收獲細胞 并通過 Western-Blot 或其他檢測手段來檢測基因表達）。

注：由于 AAV 組織特異性，體外感染細胞的效率比較低，所以我們強烈推薦您購買 AAV用于動物實驗。

七、 AAV 使用情況實例分析

?

1.AAV 感染不同種類的細胞

? ? ? AAV 雖然也可體外感染一些細胞，但感染效率比較低。具體感染效率可以參考本手冊的常見問題 解答中的附表。

2.AAV 感染神經干細胞

GFP NESTIN MERGE

Sorted cells were expanded for an additional26 days (total 40 days after AAV infection), and ~94.5% of cells maintained GFP and nestin expression

Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(4):

667-675.

由于 AAV 的低免疫原性，即便感染干細胞，也不會引起細胞的分化。

3. 各種類型的重組 AAV 注射入不同神經發育階段的小鼠腦內產生不同分布

Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680. 注射方法：腦室注射10注射劑量：2×10v.p

4.不同血清型的 AAV 感染心臟心肌細胞

由于組織特異性，即便提高病毒的注射量，對于低表達的血清型，其所攜帶基因的表達水 平沒有太大的改善。由圖可知，AAV9 型對心肌細胞的感染效率極高，AAV8 次之。

5. 重組 AAV1-SERCA2a 轉導入豬冠狀動脈的表達

Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

注射方法：冠狀動脈注射，注射劑量：10¹²v.p

6. AAV1 特異性感染中樞神經系統以及不同類型 AAV 感染中樞神經系統的效果

Edmund R Hollis II， Ken Kadoya， Matthew Hirsch， Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski

，Molecular Therapy , vol16 ,no. 2, feb, 2008.

注射方法：神經肌肉注射 注射劑量：2.1x10E8 v.p

分別用 AAV1-6 感染中樞神經系統，AAV1 的效果很好，感染運動神經元的數目較多。

7.不同血清型 AAV 體外注射大鼠 5 天后在腦的海馬回中的表達

Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006, 3 , 13(3).

8.AAV2 在研究小鼠脈絡膜新生血管形成中作為基因導入的載體

Therapeutic effect of CBAPEDF-AAV2 on choroidal neovascularization development and antibody responses to AAV2 capsid following single and sequential intravitreal injections.

A-D:Representative CNV images from mouse eyes that were untreated (A), received a single intravitreal (IV) treatment (B), received first IV treatment (C), and received a second

IV treatment (D) of AAV2-PEDF.

Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769. 注射方法：玻璃體腔內注射

注射劑量：4x10E10 V.G.

9.AAV7,8 感染視錐形細胞

注射方法：在接近晶狀體的虹膜上切開一個小口后，緩慢（20-30 秒內）注射。至少在 3個星期后進行后續的實驗。 注射劑量：2ul。

10. scAAV9 介導的 CB-GFP 標記靜脈注射入大鼠 3 周后在腦的星形膠質和神經元中表

a:紋狀體; b:海馬回；c:齒狀回；d :小腦浦肯野細胞; e:海馬回的椎體細胞 f:齒狀回的顆粒細胞；

a-d 新生鼠 e-f 成年鼠（f）200 mm (e); 100 mm (f),50 mm (a–d)

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射，注射劑量：4 × 10¹¹