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?一、?AAV 載體概述

? ?腺相關(guān)病毒(AAV)是一種無(wú)包膜的單鏈 DNA 病毒，是細(xì)小病毒家族的一員，通常需要腺病毒、皰疹病毒等輔助病毒的幫助，才能進(jìn)行自我復(fù)制。在沒(méi)有輔助病毒的情況下，

? ?AAV 可在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中長(zhǎng)期潛伏?，F(xiàn)階段已發(fā)現(xiàn)的 AAV 有 12 種的血清型（AAV1 至AAV12）和 130 多種突變型[1] 。不同 AAV 血清型具有不同的衣殼蛋白空間結(jié)構(gòu)、序列 和組織特異性，因而其識(shí)別與結(jié)合的細(xì)胞表面受體也相應(yīng)有很大差別[2]，這也導(dǎo)致不同 血清型轉(zhuǎn)染的細(xì)胞類(lèi)型和感染效率也各不相同。在基因治療中，將攜帶有外源基因的重組 腺相關(guān)病毒定點(diǎn)整合到宿主基因組，既能克服隨機(jī)插入所導(dǎo)致的染色體缺失和基因重排等 潛在危險(xiǎn)，又可以達(dá)到長(zhǎng)期治療的目的。

? ? ? 野生型 AAV 基因組編碼兩大開(kāi)放閱讀框架(open reading frames，ORF) rep 和 cap，它們位于兩側(cè)的末端倒轉(zhuǎn)重復(fù)序列(interted teminal repeats，ITRs)之間。在 維真生物 的 AAV 病毒基因傳遞系統(tǒng)中，只有 ITRs 是復(fù)制和包裝所必需的順式元件，rep 和 cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒 AAV rep/cap Vector 中，轉(zhuǎn)移后空出的位置 是允許外源基因插入病毒基因組中的較大限度。在輔助質(zhì)粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 的幫助下，僅需兩端的 ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒 顆粒。

? ? ? 重組腺相關(guān)病毒是基因傳遞和表達(dá)的一個(gè)重要工具[3]，其具有廣泛的宿主范圍及 組織感染能力，既能感染分裂細(xì)胞，也能轉(zhuǎn)導(dǎo)外源基因進(jìn)入非分裂細(xì)胞，長(zhǎng)期表達(dá)外源基 因，而不依賴(lài)于宿主細(xì)胞活躍的分裂能力。維真生物的 AAV 病毒基因傳遞系統(tǒng) 中，包含末端重復(fù)序列(ITRs)的載體質(zhì)粒 pAV-FH AAV 載體與包含 rep/cap 基因的輔助質(zhì) 粒 pAAV-rep/cap 載體沒(méi)有任何共同區(qū)域，避免通過(guò)重組而恢復(fù)出野生型病毒，宿主細(xì)胞 免疫反應(yīng)被降至較低，從而允許對(duì)具有免疫能力的宿主細(xì)胞進(jìn)行基因傳遞。我們的 AAV 病 毒基因傳遞系統(tǒng)可以生產(chǎn)出重組病毒滴度≥1011 病毒顆粒/毫升的病毒，濃縮后滴度可高達(dá) 1014 病毒顆粒/毫升，可以較大程度保證在動(dòng)物細(xì)胞中的基因傳遞。rAAV 進(jìn)入細(xì)胞 后，作為附加的 DNA 能穩(wěn)定存在?；虻谋磉_(dá)通常在第 2?7 天出現(xiàn)峰值，并可在體內(nèi)持續(xù)數(shù)周甚至數(shù)月。

二、 腺相關(guān)病毒基因傳遞和表達(dá)的優(yōu)勢(shì)

1.宿主范圍廣：隨時(shí)可轉(zhuǎn)染的 AAV 可高效感染分裂和非分裂細(xì)胞；

2.多種血清型 ：AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8 和 AAV9 等

3.安全性高：ITR 序列和 rep/cap 基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá)；未發(fā)現(xiàn) AAV 對(duì)人體致 病，rAAV 去除了 wtAAV 基因組的 96%，進(jìn)一步保證了安全性；

4.免疫原性低：AAV2 的基因組僅 4681 個(gè)核苷酸，便于用常規(guī)的重組 DNA 技術(shù)進(jìn)行操 作，而且進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)造成的免疫反應(yīng)

小。

三、 維真生物腺相關(guān)病毒的優(yōu)勢(shì)

1）載體全：不同的啟動(dòng)子（神經(jīng)特異性啟動(dòng)子 Human Synapsin、CamkIIα、GFAP 等）和多種報(bào)告基因（EGFP、mCherry、RFP 和 luciferase 等）可供客戶(hù)選擇；

2) 貨期短：AAV 克隆載體均與我們 18,000 個(gè)預(yù)制人類(lèi)全長(zhǎng) cDNA ORF 克隆載體 MCS 區(qū) 通用，行業(yè)中短的生產(chǎn)周期2-3即可發(fā)貨；

3）滴度高：可提供 1012V.G/ml 及以上滴度的病毒.，可高達(dá) 1014V.G/ml；

4）服務(wù)優(yōu)：可根據(jù)客戶(hù)的具體需求提供特殊定制服務(wù)。

四、 維真生物rAAV產(chǎn)品簡(jiǎn)介

? ? 維真生物 獨(dú)有的**技術(shù)和創(chuàng)新性的 rAAV 載體和完善的 AAV 表達(dá)系統(tǒng)，可用于體內(nèi)和體外表達(dá) shRNA，human ORF 和 CRISPR，具有穩(wěn)定可靠、重復(fù)性好、純度高、滴度 高的優(yōu)點(diǎn)。

? ? ? AAV無(wú)輔助病毒系統(tǒng)（AAV Helper-Free System）可以在無(wú)輔助病毒的條件下生產(chǎn)出 重組人腺相關(guān)病毒。這種系統(tǒng)利用已經(jīng)明確與調(diào)節(jié)AAV 復(fù)制和表達(dá)的腺病毒基因產(chǎn)物，并 且將這些基因產(chǎn)物通過(guò)轉(zhuǎn)染引進(jìn)宿主細(xì)胞。重組腺相關(guān)病毒（rAAV）由多個(gè)質(zhì)粒（Cis質(zhì) 粒、輔助質(zhì)粒、Rep/Cap質(zhì)粒）組成。生產(chǎn)具感染性的AAV 病毒顆粒所需的腺病毒基因產(chǎn) 物（例如：E2A,E4 和VA RNA 基因）大部分由與其他質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞的pHelper 質(zhì)粒提 供，其余的腺病毒基因產(chǎn)物由穩(wěn)定表達(dá)腺病毒E1 基因的AAV-293T 宿主細(xì)胞提供。Rep 和 Cap 基因從病毒載體中被轉(zhuǎn)移到輔助質(zhì)粒pAAV-RC 中，AAV ITRs 仍位于病毒載體中，實(shí) 際上在輔助質(zhì)粒的幫助下，僅需兩端的ITR 就能將攜帶的外源片段包裝進(jìn)入腺相關(guān)病毒顆 粒，Rep 和Cap 基因的轉(zhuǎn)移后空出的位置是允許外源基因插入病毒基因組中的較大限度。 Cis質(zhì)粒、輔助質(zhì)粒與Rep/Cap質(zhì)粒之間不具有同源性序列，因此重組AAV在理論上不具有 復(fù)制的能力。維真生物的腺相關(guān)病毒載體ITR序列Rep/Cap基因分別由獨(dú)立的質(zhì)粒表達(dá),具 有高度安全性。

rAAV進(jìn)入細(xì)胞和轉(zhuǎn)運(yùn)的過(guò)程

1.rAAV 載體

?

? ? ? 維真生物為您提供了多種腺相關(guān)病毒載體。包裝 AAV 無(wú)需輔助腺病毒，非致病 性、免疫原性低。AAV 包裝系統(tǒng)包括輔助質(zhì)粒和 Rep/Cap 質(zhì)粒，ITR 序列和 rep/cap 基 因分別位于獨(dú)立的質(zhì)粒，安全性高。多種血清型 (AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、 AAV8、AAV9)可供選擇。根據(jù)不同客戶(hù)的需要，提供了分別適用于 human ORF、shRNA 和 CRISPR 、TALEN 基因組靶向操作服務(wù)的 AAV 載體。

2.rAAV 克隆服務(wù)

? 2.1 rAAV Human ORF 克隆服務(wù)

? ? ?維真生物 為 human ORF 克隆設(shè)計(jì)的 pAV-FH AAV 載體，具有 Amp 抗性、CMV 啟動(dòng)子，帶有 Flag-His 標(biāo)簽。多克隆位點(diǎn)與維真生物的 human ORF 穿梭克隆 相兼容。非常適于哺乳動(dòng)物 ORF 的表達(dá)。

??

? ? ? 2.2 rAAV shRNA 克隆服務(wù)

? ? ??? ? ? ? ? ??

? ? ? 維真生物 為您提供了多種表達(dá) shRNA 的 rAAV，包括 U6 或 H1 啟動(dòng)子和作為哺乳動(dòng)物 表達(dá)標(biāo)記的 GFP 或 RFP。同時(shí)，也可根據(jù)您感興趣的基因提供 shRNA 設(shè)計(jì)服務(wù)。

2.3 rAAV載體容量

?

腺相關(guān)病毒載體能夠感染分裂和非分裂細(xì)胞。毒性和免疫原性低，適合以相對(duì)較高的 轉(zhuǎn)染效率在非分裂細(xì)胞中長(zhǎng)期表達(dá)和在分裂細(xì)胞中短期表達(dá)基因。但AAV載體的外源基因 容納量有限，兩個(gè)ITR之間的空間只有4.7kb，因此可插入的外源基因?yàn)?.5kb甚至更小。 請(qǐng)參閱本表選擇適合您的病毒載體系統(tǒng)。

五、腺相關(guān)病毒顆粒生產(chǎn)流程

? ? ? 第一步：基因克隆。將外源基因克隆進(jìn)入 維真生物公司的人源或 shRNA 腺相關(guān)病毒載 體，pAV-FH AAV 等載體的多克隆位點(diǎn)與我們的 human ORF 穿梭克隆相兼容，非常適于哺

乳動(dòng)物 ORF 的表達(dá)。

? ? ? 第二步：細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將攜帶外源基因的重組質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒 Ad Helper Vector 和 pAAV- rep/cap Vector 共轉(zhuǎn)染進(jìn)入 HEK293T 細(xì)胞，感染 72h 之后即包裝完畢。

? ? ? 第三步：收毒。分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞沉淀，PEG8000 沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，培養(yǎng) 基上清先用 0.45um 濾膜過(guò)濾。

? ? ? 第四步：病毒純化。通過(guò)碘克沙醇法對(duì)病毒進(jìn)行純化，一方面提高病毒滴度，另一方面某些 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)需要純化之后才可進(jìn)行。

? ? ? 第五步：滴度檢測(cè)。用 QPCR 的方法來(lái)檢測(cè)病毒的滴度，得到的結(jié)果為包裝得到的病毒顆粒數(shù)。

?

? ? ? 維真生物 的 pAV-FH AAV 載體，具有 Amp 抗性、CMV 啟動(dòng)子，帶有 Flag-His 標(biāo)簽。多克隆 位點(diǎn)與 維真生物 的 human ORF 穿梭克隆相兼容。非常適于哺乳動(dòng)物 ORF 的表達(dá)。維真生物 為您提供了多種表達(dá) shRNA 的 rAAV，包括 U6 或 H1 啟動(dòng)子和作為哺乳動(dòng)物表達(dá)標(biāo)記的 GFP 或 RFP。同時(shí)，也可根據(jù)您感興趣的基因提供 shRNA 設(shè)計(jì)服務(wù)。

? ? ? pAAV-rep/cap 質(zhì)粒（圖）包含 AAV 編碼復(fù)制蛋白和病毒衣殼蛋白的 rep 和 cap 基因，獲得 期望的高滴度病毒產(chǎn)品的關(guān)鍵基因。

pHelper 質(zhì)粒（圖）包含 AAV-HEK293T 生產(chǎn)高滴度病毒必須的的腺病毒基因 VA，E2A 和 E4的集合。提供 AAV 生產(chǎn)所必需的腺病毒蛋白質(zhì) E1A 和 E1B 在 HEK293T 細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。

生產(chǎn)流程示意圖

1.腺相關(guān)病毒重組克隆構(gòu)建

? ? 1）根據(jù)訂單不同選擇不同的載體，在此以人源基因克隆為例。

? ? 2）維真生物公司的 AAV 載體與我們的人源 ORF 庫(kù)中的穿梭質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)相兼容，通過(guò)酶 切，連接，轉(zhuǎn)化的方式將基因亞克隆進(jìn)入 pAV-FH AAV 載體，得到陽(yáng)性克隆之后進(jìn)行酶切跑膠驗(yàn) 證及測(cè)序以確認(rèn)插曲片段的正確性。

2.細(xì)胞凍存流程

? ??1)按照培養(yǎng)細(xì)胞流程，將細(xì)胞吹下來(lái)加入 50ml 離心管中， 800g 離心 5min。

? ? 2)配制凍存液，90% 血清，10% DMSO，混勻。

? ? 3)離心后去上清，將配制的凍存液加入，將細(xì)胞吹勻

? ??4)取上述溶液 1ml 分至 1.5ml 細(xì)胞凍存管中，做好標(biāo)記和日期。

? ? 5)放入裝有異丙醇的凍存盒中，放入-80 度冰箱過(guò)夜。（凍存盒要提前一天從冰箱中拿至室 溫，使異丙醇的溫度達(dá)到室溫，每次凍存前確保異丙醇的加入量在刻度線(xiàn)上）。

? ? 6)第二天將凍存盒放入液氮或-150℃冰箱中。

3.細(xì)胞復(fù)蘇流程

?

? ??1)10cm 培養(yǎng)盤(pán)中加 10cm 新鮮 DMEM 培養(yǎng)基，放培養(yǎng)箱預(yù)熱至 37℃。

? ? 2)從液氮中取出冷凍管，迅速投入 37 ℃ ～38℃水浴中，使其融化（1-2 分鐘左右）。

? ? 3)待細(xì)胞凍存管中溶液尚未完全融化時(shí)加入預(yù)熱的培養(yǎng)盤(pán)中。

? ?4)搖晃均勻，放培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

? ? 5)4h 后待細(xì)胞完全貼壁后更換新鮮培養(yǎng)基（除去凍存液中 DMSO 對(duì)細(xì)胞的毒害作用。也可在第 3步中 800g 離心 5min，除去培養(yǎng)基后再懸浮細(xì)胞添加至新鮮預(yù)熱的 DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)皿中）。

4.細(xì)胞培養(yǎng)流程（以 10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿，傳代為例）

? ??1)生物安全柜紫外滅菌半小時(shí)。

? ? 2)滅菌期間，DMEM 培養(yǎng)基(含 10%FBS，1%青鏈霉素混合液)、PBS 以及 0.25%胰酶在 37℃水浴鍋中預(yù)熱。

? ? 3)取匯合度接近 100%活性好的的 HEK293T 細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)盤(pán)中培養(yǎng)基，加約 5ml，1×PBS，搖晃幾下，吸棄 PBS。（加 PBS 目的主要除去殘留在皿中的培養(yǎng)基中的 FBS，以提 高胰酶的消化效率）

? ??4)加 1ml 0.25% 胰酶在生物安全柜內(nèi)消化約 1min，室溫低時(shí)可放置于培養(yǎng)箱中消化。消 化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng)，否則影響細(xì)胞再次貼壁效率和活性。

? ? 5)加入約 5ml 的預(yù)熱的培養(yǎng)基。

? ? 6)用移液管吹打均勻，按照 1:3 比例傳代。各洗 2ml 培養(yǎng)基至新的 10cm 皿中，再加入8ml 預(yù)熱的 DMEM 培養(yǎng)基。（吹打過(guò)程中不可用力過(guò)大，否則會(huì)吹破細(xì)胞）。

? ? 注意：傳代盤(pán)數(shù)較多時(shí)，要先將預(yù)熱的 DMEM 培養(yǎng)基加入到 10cm 皿中，再加入含細(xì)胞的培 養(yǎng)基，以避免細(xì)胞分布不均。放置于培養(yǎng)箱前輕輕混勻皿中的培養(yǎng)基，使細(xì)胞均勻分散于 培養(yǎng)基中。細(xì)胞培養(yǎng)條件為 5%-7%CO2 濃度，37℃，培養(yǎng)箱內(nèi)無(wú)菌水盤(pán)內(nèi)水份提供一定的 濕度。細(xì)胞傳盤(pán)以及分 6 孔板，24 孔板，96 孔板分細(xì)胞都經(jīng)過(guò)上述流程，只是細(xì)胞數(shù)與分的比 例不同，具體情況具體操作。

5.AAV 病毒包裝

?

? ??以 10cm 細(xì)胞培養(yǎng)皿為例

? ? 第一天: 聚合度 90%以上的 HEK293T 細(xì)胞按 1：3 比例傳盤(pán)（每盤(pán)大約 2.5 x 106），培 養(yǎng)基 Hyclone 高糖 DMEM 培養(yǎng)基（含 10%FBS）。

? ? 第二天: 轉(zhuǎn)質(zhì)粒前 1-2h 左右，換成無(wú)血清培養(yǎng)基（所有血清型 AAV），用轉(zhuǎn)染試劑將目 的基因質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒（需用酚氯仿提取的質(zhì)粒）轉(zhuǎn)入 HEK293T 中。

? ??第三天：質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 24h 后，換新的無(wú)血清培養(yǎng)基（所有血清型 AAV）

? ? 第五天：轉(zhuǎn)染 72h 收毒。帶著培養(yǎng)基，吹下細(xì)胞，離心；然后分別收獲培養(yǎng)基上清與細(xì)胞 沉淀。用 PEG8000 沉淀培養(yǎng)基上清中的病毒，沉淀過(guò)夜后收集病毒沉淀。

6.AAV 病毒純化

? ??1)收集病毒沉淀和細(xì)胞沉淀。

? ? 2)細(xì)胞沉淀-80℃保存，后續(xù)實(shí)驗(yàn)用。

? ? 3)破碎細(xì)胞。

? ??4) 將病毒的混合液用碘克沙醇密度梯度離心進(jìn)行純化。

7.病毒濃縮

? ? 用超濾管進(jìn)行濃縮。

8.病毒滴度檢驗(yàn)

? ? ?1)腺性相關(guān)病毒處理破除 AAV 病毒外殼 ，37 ℃ 孵育 30 min，然后加熱 95 ℃5 min 使 酶失活，體系如下：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?組成成分 ? ? ? ? ? ? ? 體積

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 病毒液 ? ? ? ? ? ? ? ??5ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?蛋白酶 K（5ug/ul） ? ?1ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 超純水 ? ? ? ? ? ? ? 4ul

? ? 2)離心 12000rpm,2min.取上清。

? ? 3)標(biāo)準(zhǔn)品的拷貝數(shù)，7 個(gè)梯度稀釋濃度分別：

? ??7.2E+8V.G./UL,7.2E+7V.G./UL,7.2E+6V.G./UL,7.2E+5V.G./UL,7.2E+4V.G./UL,7.2E+3V. G./UL,7.2E+2V.G./UL.并將超純水作為陰性對(duì)照。

? ? 4)配制 PCR 反應(yīng)體系，每個(gè)樣品 20 ul 體系，體系如下：

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?組成成分 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?體積

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2X SYBRGreen 緩沖液? ? ? ? ? ? ? ?10ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??F、R 引物混合物 ? ? ? ? ? ? ? ? ??0.8ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??超純水 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ??7.2ul

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?病毒樣品或標(biāo)準(zhǔn)品 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 2ul

? ? ?5)PCR 反應(yīng)體系

? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?

95℃ ?? ? ?5min；

95℃ ? ? ? ? 15sec

60℃ ? ? ? ? 15sec

72℃ ? ? ? ?15sec

40 個(gè) ? ? ??cycles

? ? 6)病毒顆粒數(shù)公式：病毒顆粒數(shù)（個(gè)/ml）= 與標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)值 × 1000

六、 腺相關(guān)病毒感染目的細(xì)胞預(yù)實(shí)驗(yàn)

?

? ? ? 以 2 型 AAV 病毒為例，維真生物為您推薦的 MOI 值 10000:1-100000:1，是根HEK293T 細(xì)胞得出的數(shù)據(jù)，不同的細(xì)胞所使用的病毒 MOI 值會(huì)有所不同。建議您感染目的 細(xì)胞前，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索最佳 MOI 值，推薦使用有熒光的對(duì)照病毒來(lái)摸索條件。

? ? 1. 為了節(jié)省病毒，推薦使用 96 孔板進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)。

? ? 2. 將目的細(xì)胞接種于 96 孔板中，細(xì)胞融合率為 50%為最佳。為保證細(xì)胞生長(zhǎng)良好，請(qǐng)保 證細(xì)胞貼壁過(guò)夜。

? ??3. 取 10ul AAV 病毒原液加入 90 ul 培養(yǎng)基中做 1:100 稀釋?zhuān)?0-2），以此為起點(diǎn)做梯度 稀釋直至稀釋 10-7。可根據(jù)實(shí)際情況降低或提高稀釋倍數(shù)。

? ?4. 取出提前準(zhǔn)備好的 96 孔板，先確定細(xì)胞生長(zhǎng)狀況是否良好。用準(zhǔn)備好的病毒稀釋液替 代舊培養(yǎng)基，注意保留未加入病毒的細(xì)胞孔作為對(duì)照組。

? ?5. 在加入病毒稀釋液后，請(qǐng)?jiān)?12-24h 后觀察細(xì)胞狀態(tài)來(lái)確認(rèn)加入的病毒量是否合適，是 否因?yàn)榧尤氲牟《玖坑绊懠?xì)胞狀態(tài)。如果細(xì)胞沒(méi)有變化，即所加病毒對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性，可 以繼續(xù)培養(yǎng)。

? ?6. AAV 病毒對(duì)細(xì)胞的感染較慢，請(qǐng)?jiān)诟腥炯?xì)胞后每天觀察細(xì)胞中熒光表達(dá)情況。 (成功 案例: 山大醫(yī)院學(xué)生利用我司提供的 AAV 病毒感染 jurkat，ca46 細(xì)胞,在 MOI 值 105 時(shí),一個(gè)星期后看到熒光表達(dá),并且成功通過(guò) WB 檢測(cè)到目的基因的表達(dá))（如果您選擇的產(chǎn)

品帶有 GFP 標(biāo)簽，如果沒(méi)有熒光標(biāo)簽請(qǐng)選擇在 96 小時(shí)以后的不同時(shí)間段分別收獲細(xì)胞 并通過(guò) Western-Blot 或其他檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)基因表達(dá)）。

注：由于 AAV 組織特異性，體外感染細(xì)胞的效率比較低，所以我們強(qiáng)烈推薦您購(gòu)買(mǎi) AAV用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

七、 AAV 使用情況實(shí)例分析

?

1.AAV 感染不同種類(lèi)的細(xì)胞

? ? ? AAV 雖然也可體外感染一些細(xì)胞，但感染效率比較低。具體感染效率可以參考本手冊(cè)的常見(jiàn)問(wèn)題 解答中的附表。

2.AAV 感染神經(jīng)干細(xì)胞

GFP NESTIN MERGE

Sorted cells were expanded for an additional26 days (total 40 days after AAV infection), and ~94.5% of cells maintained GFP and nestin expression

Jang J H, Koerber J T, Kim J S, et al. An evolved adeno-associated viral variant enhances gene delivery and gene targeting in neural stem cells[J]. Molecular Therapy, 2011, 19(4):

667-675.

由于 AAV 的低免疫原性，即便感染干細(xì)胞，也不會(huì)引起細(xì)胞的分化。

3. 各種類(lèi)型的重組 AAV 注射入不同神經(jīng)發(fā)育階段的小鼠腦內(nèi)產(chǎn)生不同分布

Chakrabarty P, Rosario A, Cruz P, et al. Capsid serotype and timingof injection determines AAV transduction in the neonatal mice brain[J]. PloS one, 2013, 8(6): e67680. 注射方法：腦室注射10注射劑量：2×10v.p

4.不同血清型的 AAV 感染心臟心肌細(xì)胞

由于組織特異性，即便提高病毒的注射量，對(duì)于低表達(dá)的血清型，其所攜帶基因的表達(dá)水 平?jīng)]有太大的改善。由圖可知，AAV9 型對(duì)心肌細(xì)胞的感染效率極高，AAV8 次之。

5. 重組 AAV1-SERCA2a 轉(zhuǎn)導(dǎo)入豬冠狀動(dòng)脈的表達(dá)

Hadri L, Bobe R, Molecular Therapy, 2010, 18(7): 1284-1292.

注射方法：冠狀動(dòng)脈注射，注射劑量：10¹²v.p

6. AAV1 特異性感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及不同類(lèi)型 AAV 感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)的效果

Edmund R Hollis II， Ken Kadoya， Matthew Hirsch， Richard J Samulskiand Mark H Tuszynski

，Molecular Therapy , vol16 ,no. 2, feb, 2008.

注射方法：神經(jīng)肌肉注射 注射劑量：2.1x10E8 v.p

分別用 AAV1-6 感染中樞神經(jīng)系統(tǒng)，AAV1 的效果很好，感染運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的數(shù)目較多。

7.不同血清型 AAV 體外注射大鼠 5 天后在腦的海馬回中的表達(dá)

Ronald L. Klein, Robert D. Dayton, Nancy J. Leidenheimer, Karen Jansen, Todd E. Golde, and Richard M. Zweig. MOLECULAR THERAPY, 2006, 3 , 13(3).

8.AAV2 在研究小鼠脈絡(luò)膜新生血管形成中作為基因?qū)氲妮d體

Therapeutic effect of CBAPEDF-AAV2 on choroidal neovascularization development and antibody responses to AAV2 capsid following single and sequential intravitreal injections.

A-D:Representative CNV images from mouse eyes that were untreated (A), received a single intravitreal (IV) treatment (B), received first IV treatment (C), and received a second

IV treatment (D) of AAV2-PEDF.

Qiuhong Li, Rehae Miller, Ping-Yang Han, Jijing Pang, Astra Dinculescu, Vince Chiodo, William W. Hauswirth. Molecular Vision, 2008, 14:1760-1769. 注射方法：玻璃體腔內(nèi)注射

注射劑量：4x10E10 V.G.

9.AAV7,8 感染視錐形細(xì)胞

注射方法：在接近晶狀體的虹膜上切開(kāi)一個(gè)小口后，緩慢（20-30 秒內(nèi)）注射。至少在 3個(gè)星期后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。 注射劑量：2ul。

10. scAAV9 介導(dǎo)的 CB-GFP 標(biāo)記靜脈注射入大鼠 3 周后在腦的星形膠質(zhì)和神經(jīng)元中表

a:紋狀體; b:海馬回；c:齒狀回；d :小腦浦肯野細(xì)胞; e:海馬回的椎體細(xì)胞 f:齒狀回的顆粒細(xì)胞；

a-d 新生鼠 e-f 成年鼠（f）200 mm (e); 100 mm (f),50 mm (a–d)

Foust K D, et al. Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes[J]. Nature biotechnology, 2009, 27(1): 59-65.

注射方法：尾靜脈注射，注射劑量：4 × 10¹¹