近年來，隨著生物制藥的迅猛發(fā)展，以及在疫情期間細(xì)胞和基因治療以及mRNA疫苗的出現(xiàn)，確保生物制藥的安全性和可靠性已成為全球監(jiān)管機構(gòu)和政府關(guān)注的焦點。支原體污染是一種常見但往往難以消除的污染類型。監(jiān)管要求規(guī)定，涉及細(xì)胞培養(yǎng)的生物工藝過程必須確保“無支原體污染”。
支原體檢測法規(guī)要求
原材料→細(xì)胞培養(yǎng)基→種子細(xì)胞→種子細(xì)胞培養(yǎng)→細(xì)胞收集→細(xì)胞純化→終產(chǎn)品
在《中華人民共和國藥典》2020年版第三部“生物制品生產(chǎn)用動物細(xì)胞基質(zhì)的制備和質(zhì)量控制”中，提出對于生產(chǎn)細(xì)胞，應(yīng)在主細(xì)胞庫（MCB）、工作細(xì)胞庫（WCB）和生產(chǎn)結(jié)束細(xì)胞（EOPC）進(jìn)行支原體檢測。
在“細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）”中，建議在關(guān)鍵時間點對適當(dāng)?shù)闹虚g樣品進(jìn)行支原體和其他與安全相關(guān)的檢測，或采取相關(guān)措施進(jìn)行控制。最終產(chǎn)品的放行檢測也要求進(jìn)行支原體檢測。
根據(jù)美國FDA的“用于傳染病指示病毒疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)和其他生物材料的特性和鑒定指南”，要求對原材料、病毒種子和未加工收獲液進(jìn)行支原體控制。
核酸檢測（NAT）和傳統(tǒng)方法
在核酸檢測（NAT）作為一種快速檢測方法出現(xiàn)之前，傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法和指示細(xì)胞測定法由于其較長的檢測周期或敏感性問題，導(dǎo)致了生產(chǎn)周期的延長或需要根據(jù)風(fēng)險評估或?qū)ふ姨娲椒▉碛袟l件地放行細(xì)胞基質(zhì)。隨著細(xì)胞和基因治療的發(fā)展，行業(yè)對病原體檢測的及時性和敏感性的需求增加了。更短的貨架期不足以支持如此長的檢測周期，因此NAT方法在眾多病原體檢測方法中脫穎而出。
目前，歐洲藥典（EP）<2.6.7>、日本藥典（JP）和美國藥典（USP）<63>都已將NAT方法作為病原體檢測方法。但是，在使用前需要驗證這種方法，并與傳統(tǒng)方法比較其檢測敏感性。盡管2020年版的中國藥典（ChP）沒有將NAT作為病原體檢測方法，但它提到可以使用“國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)的其他方法”。
2022年5月，國家藥品監(jiān)督管理局藥品審評中心發(fā)布了《細(xì)胞治療產(chǎn)品藥學(xué)研究與評價技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》，其中指出：“當(dāng)樣本量有限，或需要快速放行，且藥典方法不適用時，可以開發(fā)新的無菌及病原體檢測方法用于放行檢測，但這些新檢測方法應(yīng)進(jìn)行充分的驗證。”因此，預(yù)計NAT將越來越多地被原料供應(yīng)商和先進(jìn)治療藥物產(chǎn)品（ATMP）公司作為能夠支持快速病原體放行檢測的方法所使用。
NAT方法驗證要求
NAT方法的驗證在歐洲藥典<2.6.7>和日本藥典中都有詳細(xì)說明，且內(nèi)容基本一致。國家食品藥品檢定研究院（NIFDC）還發(fā)表了一篇題為“病原體核酸檢測方法及方法學(xué)驗證的考慮”的文章，旨在為中國核酸擴(kuò)增方法病原體檢測的開發(fā)者和用戶提供指導(dǎo)。病原體檢測的NAT方法需要進(jìn)行特異性、檢測限和穩(wěn)健性驗證。如果使用商業(yè)化檢測試劑盒進(jìn)行病原體檢測，則可以根據(jù)供應(yīng)商提供的全面試劑盒性能驗證報告，結(jié)合實驗室環(huán)境和樣本類型，進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆椒ㄟm用性驗證。
特異性
特異性指的是在其他成分（如雜質(zhì)、降解產(chǎn)物、輔料等）存在的情況下，分析方法準(zhǔn)確測量目標(biāo)分析物的能力。在歐洲藥典（EP）中提到，在驗證過程中，應(yīng)注意與密切相關(guān)的細(xì)菌種類之間的交叉反應(yīng)，如包括梭菌屬（Clostridium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）的革蘭氏陽性菌。此外，還應(yīng)考慮宿主細(xì)胞和實驗室操作環(huán)境中常見的人類DNA污染類型。
檢測限
檢測限指的是樣品中能夠被檢測出的分析物的最低量。檢測限作為限度檢驗和定性鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，不需要被準(zhǔn)確定量為一個確切值。在歐洲藥典（EP）中，要求每種病原體和每個稀釋濃度都有24個檢測數(shù)據(jù)點。這可以通過在不同天進(jìn)行三次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度進(jìn)行8次重復(fù)檢測來實現(xiàn)；或者在不同天進(jìn)行四次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度進(jìn)行6次重復(fù)檢測。建立檢測限需要超過95%的檢測陽性率。
對于需要確認(rèn)檢測限的病原體類型，試劑盒制造商應(yīng)盡可能多地覆蓋法規(guī)藥典要求的病原體類型，并探索每種病原體的檢測限。對于生物制藥公司來說，通常需要根據(jù)實際使用的原材料來源進(jìn)行選擇。此外，還應(yīng)考慮人類來源的病原體類型。
如果在生產(chǎn)過程中使用或接觸到禽類細(xì)胞或材料，則應(yīng)進(jìn)行雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae）的檢測限驗證。
如果在生產(chǎn)過程中使用或接觸到昆蟲或植物材料，則應(yīng)進(jìn)行螺旋體（Spiroplasma）的檢測限驗證。
豬鼻支原體（Porcine nasal mycoplasma）在支原體污染樣本中高度流行，并已受到中國國家食品藥品檢定研究院的關(guān)注。
與歐洲藥典相比，日本藥典在檢測限驗證中沒有提及雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum）。相反，它除了提及的標(biāo)準(zhǔn)之外，還包括了口腔支原體（Mycoplasma orale）。
耐受性
耐受性指的是在測量條件發(fā)生小的變化時，測量結(jié)果不受影響的程度，為所建立方法在常規(guī)測試中的使用提供了依據(jù)。在評估耐受性時，需要注意病原體檢測方法對檢測試劑中MgCl2、引物和dNTPs濃度變化的耐受性，核酸提取試劑盒或提取步驟的變化，以及對使用不同核酸擴(kuò)增儀器的耐受性。
可比性研究
如果NAT方法要用作替代藥典方法，需要通過比較確認(rèn)NAT能夠替代基于培養(yǎng)的方法或指示細(xì)胞培養(yǎng)方法。通常，這涉及到考慮方法的檢測限以及特異性（如覆蓋的病原體范圍和潛在的假陽性）。對于檢測限的比較，必須滿足“檢測限達(dá)到10 CFU/mL可以替代基于培養(yǎng)的方法；檢測限達(dá)到100 CFU/mL可以替代指示細(xì)胞培養(yǎng)方法”的標(biāo)準(zhǔn)。
進(jìn)行可比性研究有兩種可選的方法：
1、使用相同的驗證過的病原體菌株，對NAT方法和藥典方法同時進(jìn)行同步實驗，以確認(rèn)檢測限。
2、將NAT的驗證結(jié)果與藥典方法的驗證結(jié)果進(jìn)行比較，但需要仔細(xì)記錄兩種方法中使用的病原體標(biāo)準(zhǔn)品的確認(rèn)文件。
DfCell支原體檢測的驗證內(nèi)容
產(chǎn)品推薦
Arcegen Bioscience DfCell支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）是一種基于核酸擴(kuò)增技術(shù)（NAT）的快速定性檢測解決方案。它旨在檢測原材料、細(xì)胞庫、病毒種子、病毒或細(xì)胞收獲液以及治療細(xì)胞中潛在的支原體污染。該試劑盒利用定量PCR技術(shù)和Taqman熒光探針，對測試樣本中的支原體DNA進(jìn)行定性檢測，覆蓋超過160種不同的支原體DNA序列。它已根據(jù)EP 2.6.7和JP G3對支原體檢測的指導(dǎo)方針和要求進(jìn)行了嚴(yán)格的驗證，顯示出高靈敏度、卓越的特異性和安全性。
它可以與基于磁珠的殘留DNA樣本前處理試劑盒結(jié)合使用，進(jìn)行手動提取，或使用Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀器進(jìn)行自動化核酸提取。在前處理去除干擾雜質(zhì)并獲得純化的支原體DNA后，通過qPCR收集探針的熒光信號，從而確定檢測結(jié)果。
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Product Name |
Catalog Number |
Specifications |
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C230106E |
25 T |
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C230106S |
100T |