近年來，隨著生物制藥的迅猛發展，以及在疫情期間細胞和基因治療以及mRNA疫苗的出現，確保生物制藥的安全性和可靠性已成為全球監管機構和政府關注的焦點。支原體污染是一種常見但往往難以消除的污染類型。監管要求規定，涉及細胞培養的生物工藝過程必須確保“無支原體污染”。

支原體檢測法規要求

原材料→細胞培養基→種子細胞→種子細胞培養→細胞收集→細胞純化→終產品

在《中華人民共和國藥典》2020年版第三部“生物制品生產用動物細胞基質的制備和質量控制”中，提出對于生產細胞，應在主細胞庫（MCB）、工作細胞庫（WCB）和生產結束細胞（EOPC）進行支原體檢測。

在“細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）”中，建議在關鍵時間點對適當的中間樣品進行支原體和其他與安全相關的檢測，或采取相關措施進行控制。最終產品的放行檢測也要求進行支原體檢測。

根據美國FDA的“用于傳染病指示病毒疫苗生產的細胞基質和其他生物材料的特性和鑒定指南”，要求對原材料、病毒種子和未加工收獲液進行支原體控制。

核酸檢測（NAT）和傳統方法

在核酸檢測（NAT）作為一種快速檢測方法出現之前，傳統的基于培養的方法和指示細胞測定法由于其較長的檢測周期或敏感性問題，導致了生產周期的延長或需要根據風險評估或尋找替代方法來有條件地放行細胞基質。隨著細胞和基因治療的發展，行業對病原體檢測的及時性和敏感性的需求增加了。更短的貨架期不足以支持如此長的檢測周期，因此NAT方法在眾多病原體檢測方法中脫穎而出。

目前，歐洲藥典（EP）<2.6.7>、日本藥典（JP）和美國藥典（USP）<63>都已將NAT方法作為病原體檢測方法。但是，在使用前需要驗證這種方法，并與傳統方法比較其檢測敏感性。盡管2020年版的中國藥典（ChP）沒有將NAT作為病原體檢測方法，但它提到可以使用“國家藥品監督管理部門批準的其他方法”。

2022年5月，國家藥品監督管理局藥品審評中心發布了《細胞治療產品藥學研究與評價技術指導原則（試行）》，其中指出：“當樣本量有限，或需要快速放行，且藥典方法不適用時，可以開發新的無菌及病原體檢測方法用于放行檢測，但這些新檢測方法應進行充分的驗證。”因此，預計NAT將越來越多地被原料供應商和先進治療藥物產品（ATMP）公司作為能夠支持快速病原體放行檢測的方法所使用。

NAT方法驗證要求

NAT方法的驗證在歐洲藥典<2.6.7>和日本藥典中都有詳細說明，且內容基本一致。國家食品藥品檢定研究院（NIFDC）還發表了一篇題為“病原體核酸檢測方法及方法學驗證的考慮”的文章，旨在為中國核酸擴增方法病原體檢測的開發者和用戶提供指導。病原體檢測的NAT方法需要進行特異性、檢測限和穩健性驗證。如果使用商業化檢測試劑盒進行病原體檢測，則可以根據供應商提供的全面試劑盒性能驗證報告，結合實驗室環境和樣本類型，進行適當的方法適用性驗證。

特異性

特異性指的是在其他成分（如雜質、降解產物、輔料等）存在的情況下，分析方法準確測量目標分析物的能力。在歐洲藥典（EP）中提到，在驗證過程中，應注意與密切相關的細菌種類之間的交叉反應，如包括梭菌屬（Clostridium）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）的革蘭氏陽性菌。此外，還應考慮宿主細胞和實驗室操作環境中常見的人類DNA污染類型。

檢測限

檢測限指的是樣品中能夠被檢測出的分析物的最低量。檢測限作為限度檢驗和定性鑒定的標準，不需要被準確定量為一個確切值。在歐洲藥典（EP）中，要求每種病原體和每個稀釋濃度都有24個檢測數據點。這可以通過在不同天進行三次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度進行8次重復檢測來實現；或者在不同天進行四次獨立的10倍系列梯度稀釋，每個稀釋梯度進行6次重復檢測。建立檢測限需要超過95%的檢測陽性率。

對于需要確認檢測限的病原體類型，試劑盒制造商應盡可能多地覆蓋法規藥典要求的病原體類型，并探索每種病原體的檢測限。對于生物制藥公司來說，通常需要根據實際使用的原材料來源進行選擇。此外，還應考慮人類來源的病原體類型。

如果在生產過程中使用或接觸到禽類細胞或材料，則應進行雞滑液囊支原體（Mycoplasma synoviae）的檢測限驗證。

如果在生產過程中使用或接觸到昆蟲或植物材料，則應進行螺旋體（Spiroplasma）的檢測限驗證。

豬鼻支原體（Porcine nasal mycoplasma）在支原體污染樣本中高度流行，并已受到中國國家食品藥品檢定研究院的關注。

與歐洲藥典相比，日本藥典在檢測限驗證中沒有提及雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum）。相反，它除了提及的標準之外，還包括了口腔支原體（Mycoplasma orale）。

耐受性

耐受性指的是在測量條件發生小的變化時，測量結果不受影響的程度，為所建立方法在常規測試中的使用提供了依據。在評估耐受性時，需要注意病原體檢測方法對檢測試劑中MgCl₂、引物和dNTPs濃度變化的耐受性，核酸提取試劑盒或提取步驟的變化，以及對使用不同核酸擴增儀器的耐受性。

可比性研究

如果NAT方法要用作替代藥典方法，需要通過比較確認NAT能夠替代基于培養的方法或指示細胞培養方法。通常，這涉及到考慮方法的檢測限以及特異性（如覆蓋的病原體范圍和潛在的假陽性）。對于檢測限的比較，必須滿足“檢測限達到10 CFU/mL可以替代基于培養的方法；檢測限達到100 CFU/mL可以替代指示細胞培養方法”的標準。

進行可比性研究有兩種可選的方法：

1、使用相同的驗證過的病原體菌株，對NAT方法和藥典方法同時進行同步實驗，以確認檢測限。

2、將NAT的驗證結果與藥典方法的驗證結果進行比較，但需要仔細記錄兩種方法中使用的病原體標準品的確認文件。

DfCell支原體檢測的驗證內容

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Arcegen Bioscience DfCell支原體qPCR檢測試劑盒（探針法）是一種基于核酸擴增技術（NAT）的快速定性檢測解決方案。它旨在檢測原材料、細胞庫、病毒種子、病毒或細胞收獲液以及治療細胞中潛在的支原體污染。該試劑盒利用定量PCR技術和Taqman熒光探針，對測試樣本中的支原體DNA進行定性檢測，覆蓋超過160種不同的支原體DNA序列。它已根據EP 2.6.7和JP G3對支原體檢測的指導方針和要求進行了嚴格的驗證，顯示出高靈敏度、卓越的特異性和安全性。

它可以與基于磁珠的殘留DNA樣本前處理試劑盒結合使用，進行手動提取，或使用Auto-Pure 32A全自動核酸提取儀器進行自動化核酸提取。在前處理去除干擾雜質并獲得純化的支原體DNA后，通過qPCR收集探針的熒光信號，從而確定檢測結果。