RNAi技術作為基因敲減的重要手段,已被廣泛用于探索基因功能、細胞信號轉導通路分析和藥物設計及開發等領域。在RNA干擾實驗中,shRNA的持續性表達通常借助于聚合酶III型啟動子驅動。常見的聚合酶III型啟動子包括U6和H1,這類啟動子主要用來啟動比較短的RNA,可以調控shRNA的高水平表達實現基因沉默,但是由于缺少組織特異性,無法滿足對特定組織中基因表達調控的需求。miRNA具有與shRNA相似的成熟機制,因此可以用miRNA的結構(目前miR-30較為常用)來表達,采用聚合酶II型啟動子驅動,不僅可以啟動較大的基因轉錄,還能實現RNA干擾的高效組織特異性表達!
01
? miRNA的細胞加工機制
miRNA的成熟機制與shRNA類似,只是多了一步核內加工的過程。miRNA在細胞核內先由RNA聚合酶II轉錄miRNA gene生成較長的初級miRNA(pri-miRNA),并被Drosha酶加工成60-70nt的具有發夾結構的RNA,即前體miRNA(pre-miRNA),隨后在Exportin-5復合物的幫助下轉運出胞核。在胞漿中由Dicer酶剪切為成熟的miRNA,隨即被整合進RISC中,通過與mRNA完全或不完全配對來調節基因表達。miRNA與mRNA的識別位點主要位于3‘UTR區,不完全的堿基配對主要引起mRNA翻譯抑制,完全或接近完全的堿基配對則對mRNA進行切割。

(Bobbin ML, Burnett JC, Rossi JJ. Genome Med. 2015.)
02
? 基于miR-30結構的shRNA設計方案
設計前先選擇合適的啟動子,并將miR-30的5'flanking region和3'flanking region序列保留,然后將其成熟區域的序列替換成靶點序列。結構示意圖如下:

shRNAmir-30設計原則:
shRNAmir-30在結構上高度類似shRNA,其設計原則可以參考shRNA,但需注意兩點:
1)?進行shRNAmir-30結構設計時一般選擇22 bp的靶序列;
2)?基于miR-30的shRNA在shRNA莖基部存在一個凸起,因此在進行正義鏈設計時,需作以下修改:堿基首位為C/G,則改為A;堿基首位為T/A,則改為C,使最終折疊的RNA中產生適當的凸起。
03
? 基于miR-30結構的shRNA優勢
1)?啟動子選擇性多:基于miR-30的shRNA可以通過多種RNA聚合酶II啟動子轉錄,包括廣譜啟動子(CMV、CAG和EF1a等)、組織特異性(hSyn、TBG和cTnT等)或誘導型啟動子(四環素啟動子TRE)。
2)?實現多個shRNA共表達:由于RNA聚合酶II可以啟動較大的基因轉錄,因此多個shRNAmiRs可以作為多順反子由單個啟動子驅動表達。
3)?可與報告基因共表達:將報告基因與shRNAmiRs作為多順反子一起共表達,實現shRNA的轉錄監測。
04
維真mir30-based shRNA服務及案例
維真生物可以根據客戶的實驗需求,將選定啟動子和shRNA序列構建至mir30-based shRNA載體上,并能提供序列篩選服務,助力篩選出干擾效果更好的shRNAmir-30,此外,我們還可進行后續慢病毒、腺病毒和腺相關病毒的包裝,實現組織特異性基因沉默,是您的理想選擇!公司有幾十種組織特異性啟動子可供選擇,涵蓋神經、肝臟、心臟、眼睛、胰腺、腎臟、血管及肌肉等組織。
下面是幾個維真客戶案例分享:
案例1- 神經
文章標題:
Stress-Induced Metabolic Disorder in Peripheral CD4+T Cells Leads to Anxiety-like Behavior
發表期刊:
Cell (IF 66.85)
合作客戶:
浙江大學靳津教授、東南大學柴人杰教授研究團隊
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基因信息 |
mAdora1:小鼠腺苷A1受體 |
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病毒產品 |
AAV9-GFAP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1) AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1) AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(scramble) |
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病毒用量 |
1E+11 vg/mouse |
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注射部位 |
左杏仁核 |
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注射方式 |
腦立體定位注射 |
案例2- 神經
文章標題:
Targeting PDK2 rescues stress-induced impaired brain energy metabolism
發表期刊:
Molecular Psychiatry (IF 13.437)
合作客戶:
山東第一醫科大學附屬濟寧第一人民醫院江沛教授研究團隊
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基因信息 |
GR:糖皮質激素受體 PDK2:丙酮酸脫氫酶激酶2 |
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病毒產品 |
AAV9-hSyn-shGR? AAV9-hSyn-shPDK2? AAV9-hSyn-shNC? |
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病毒用量 |
1 μL |
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注射部位 |
額葉皮層 |
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注射方式 |
腦立體定位注射, 0.25 μL/min |
案例3- 肝臟
文章標題:
PLK1 (polo like kinase 1)-dependent autophagyfacilitates gefitinib-induced hepatotoxicity by degrading COX6A1 (cytochrome c oxidase subunit 6A1)
發表期刊:
Autophagy(IF 13.391)
合作客戶:
浙江大學何俏軍/楊波教授研究團隊
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基因信息 |
PLK1,Polo樣激酶1 |
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實驗動物 |
C57BL/6小鼠 |
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病毒產品 |
AAV8-ALB-shPLK1 AAV8-control |
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病毒用量 |
4×10E11??vg/mouse |
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注射方式 |
尾靜脈注射 |
案例4- 肝臟
文章標題:
Hepatic DDAH1 mitigates hepatic steatosis and insulin resistance in obese mice:Involvement of reduced S100A11 expression
發表期刊:
ACTA PHARM SIN B(IF14.903)
合作客戶:
中國科學院大學陸忠兵教授研究團隊
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基因信息 |
S100a11:S100鈣結合蛋白A11 |
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實驗動物 |
HFD喂養的Ddah1f/f Ddah1HKO小鼠 |
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病毒產品 |
AAV8-TBG-shS100a11 AAV8-GFP |
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病毒用量 |
1.1×10E12 vg/mouse |
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注射方式 |
尾靜脈注射 |
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檢測時間 |
注射后4周 |
案例5- 心臟
文章標題:
KLF9 Aggravates Streptozotocin-Induced Diabetic?Cardiomyopathy by Inhibiting PPARγ/NRF2 Signalling
發表期刊:
Cells(IF?7.666)
合作客戶:
徐州醫科大學附屬醫院縱靜/錢文浩研究團隊
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基因信息 |
轉錄因子KLF9 |
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實驗動物 |
18周齡雄性C57BL/6J小鼠 |
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病毒產品 |
AAV9-cTnT-shKLF9 AAV9-shNC |
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病毒用量 |
60 μL,6.5–7.5×10E13 GC/mL per mouse |
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注射方式 |
眶后靜脈叢注射 |
案例6- 心臟
文章標題:
NKRF in Cardiac Fibroblasts Protects against Cardiac Remodeling Post-Myocardial Infarction via Human Antigen R
發表期刊:
Advanced Science(IF?15.1)
合作客戶:
山東大學齊魯醫院張澄/張猛/孔靜團隊
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基因信息 |
人抗原R-HuR |
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實驗動物 |
8周齡雄性NKRF-CKO小鼠 |
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病毒產品 |
AAV9-FSP1-shHuR |
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病毒用量 |
2.8×10E11 vg /mouse |
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注射方式 |
尾靜脈注射 |
案例7- 胰腺
文章標題:
Autotaxin signaling facilitates b cell dedifferentiation and dysfunction induced by Sirtuin 3 deficiency
發表期刊:
Molecular Metabolism (IF 8.568)
合作客戶:
香港中文大學 Alice P.S. Kong/田小雨教授研究團隊
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基因信息 |
Atx:外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(Enpp1-7)蛋白家族成員 |
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實驗動物 |
8周齡雄性Sirt3?f/f? Sirt3?f/f;Cre/+?小鼠 |
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病毒產品 |
AAV8-insulin 1-shAtx AAV8-scramble |
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病毒用量 |
1 x 10E12 genome copies |
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注射體積 |
100 μL病毒混懸液 |
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注射方式 |
腹腔注射 |
案例8- 腎臟
文章標題:
Auto- and paracrine rewiring of NIX-mediated mitophagy by insulin-like growth factor-binding protein 7 in septic AKI escalates inflammation-coupling tubular damage
發表期刊:
Life Sciences(IF6.780)??
合作客戶:
浙江省人民醫院呼邦傳老師課題組
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基因信息 |
NIX:線粒體膜蛋白基因 |
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病毒產品 |
AAV9-KSP1.3-miR30-sh.NIX AAV9-sh.scr |
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實驗動物 |
IGFBP-7?KO小鼠 |
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注射方式 |
尾靜脈注射 |
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病毒用量 |
100 μL,1×10E12 copies |
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