基因高效敲減神器:miR-30-based shRNA-自主發布-資訊-生物在線

基因高效敲減神器:miR-30-based shRNA

作者:山東維真生物科技有限公司 2023-10-19T00:00 (訪問量:27441)

RNAi技術作為基因敲減的重要手段,已被廣泛用于探索基因功能、細胞信號轉導通路分析和藥物設計及開發等領域。在RNA干擾實驗中,shRNA的持續性表達通常借助于聚合酶III型啟動子驅動。常見的聚合酶III型啟動子包括U6和H1,這類啟動子主要用來啟動比較短的RNA,可以調控shRNA的高水平表達實現基因沉默,但是由于缺少組織特異性,無法滿足對特定組織中基因表達調控的需求。miRNA具有與shRNA相似的成熟機制,因此可以用miRNA的結構(目前miR-30較為常用)來表達,采用聚合酶II型啟動子驅動,不僅可以啟動較大的基因轉錄,還能實現RNA干擾的高效組織特異性表達!

01

? miRNA的細胞加工機制

miRNA的成熟機制與shRNA類似,只是多了一步核內加工的過程。miRNA在細胞核內先由RNA聚合酶II轉錄miRNA gene生成較長的初級miRNA(pri-miRNA),并被Drosha酶加工成60-70nt的具有發夾結構的RNA,即前體miRNA(pre-miRNA),隨后在Exportin-5復合物的幫助下轉運出胞核。在胞漿中由Dicer酶剪切為成熟的miRNA,隨即被整合進RISC中,通過與mRNA完全或不完全配對來調節基因表達。miRNA與mRNA的識別位點主要位于3‘UTR區,不完全的堿基配對主要引起mRNA翻譯抑制,完全或接近完全的堿基配對則對mRNA進行切割。

(Bobbin ML, Burnett JC, Rossi JJ. Genome Med. 2015.)

02

? 基于miR-30結構的shRNA設計方案

設計前先選擇合適的啟動子,并將miR-30的5'flanking region和3'flanking region序列保留,然后將其成熟區域的序列替換成靶點序列。結構示意圖如下:

shRNAmir-30設計原則:

shRNAmir-30在結構上高度類似shRNA,其設計原則可以參考shRNA,但需注意兩點:

1)?進行shRNAmir-30結構設計時一般選擇22 bp的靶序列;

2)?基于miR-30的shRNA在shRNA莖基部存在一個凸起,因此在進行正義鏈設計時,需作以下修改:堿基首位為C/G,則改為A;堿基首位為T/A,則改為C,使最終折疊的RNA中產生適當的凸起。

03

? 基于miR-30結構的shRNA優勢

1)?啟動子選擇性多:基于miR-30的shRNA可以通過多種RNA聚合酶II啟動子轉錄,包括廣譜啟動子(CMV、CAG和EF1a等)、組織特異性(hSyn、TBG和cTnT等)或誘導型啟動子(四環素啟動子TRE)。

2)?實現多個shRNA共表達:由于RNA聚合酶II可以啟動較大的基因轉錄,因此多個shRNAmiRs可以作為多順反子由單個啟動子驅動表達。

3)?可與報告基因共表達:將報告基因與shRNAmiRs作為多順反子一起共表達,實現shRNA的轉錄監測。

04

維真mir30-based shRNA服務及案例

維真生物可以根據客戶的實驗需求,將選定啟動子和shRNA序列構建至mir30-based shRNA載體上,并能提供序列篩選服務,助力篩選出干擾效果更好的shRNAmir-30,此外,我們還可進行后續慢病毒、腺病毒和腺相關病毒的包裝,實現組織特異性基因沉默,是您的理想選擇!公司有幾十種組織特異性啟動子可供選擇,涵蓋神經、肝臟、心臟、眼睛、胰腺、腎臟、血管及肌肉等組織。

下面是幾個維真客戶案例分享:

案例1- 神經

文章標題:

Stress-Induced Metabolic Disorder in Peripheral CD4+T Cells Leads to Anxiety-like Behavior

發表期刊:

Cell (IF 66.85)

合作客戶:

浙江大學靳津教授、東南大學柴人杰教授研究團隊

基因信息

mAdora1:小鼠腺苷A1受體

病毒產品

AAV9-GFAP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)

AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)

AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(scramble)

病毒用量

1E+11 vg/mouse

注射部位

左杏仁核

注射方式

腦立體定位注射

案例2- 神經

文章標題:

Targeting PDK2 rescues stress-induced impaired brain energy metabolism

發表期刊:

Molecular Psychiatry (IF 13.437)

合作客戶:

山東第一醫科大學附屬濟寧第一人民醫院江沛教授研究團隊

基因信息

GR:糖皮質激素受體

PDK2:丙酮酸脫氫酶激酶2

病毒產品

AAV9-hSyn-shGR?

AAV9-hSyn-shPDK2?

AAV9-hSyn-shNC?

病毒用量

1 μL

注射部位

額葉皮層

注射方式

腦立體定位注射, 0.25 μL/min

案例3- 肝臟

文章標題:

PLK1 (polo like kinase 1)-dependent autophagyfacilitates gefitinib-induced hepatotoxicity by degrading COX6A1 (cytochrome c oxidase subunit 6A1)

發表期刊:

Autophagy(IF 13.391)

合作客戶:

浙江大學何俏軍/楊波教授研究團隊

基因信息

PLK1,Polo樣激酶1

實驗動物

C57BL/6小鼠

病毒產品

AAV8-ALB-shPLK1

AAV8-control

病毒用量

4×10E11??vg/mouse

注射方式

尾靜脈注射

案例4- 肝臟

文章標題:

Hepatic DDAH1 mitigates hepatic steatosis and insulin resistance in obese mice:Involvement of reduced S100A11 expression

發表期刊:

ACTA PHARM SIN B(IF14.903)

合作客戶:

中國科學院大學陸忠兵教授研究團隊

基因信息

S100a11:S100鈣結合蛋白A11

實驗動物

HFD喂養的Ddah1f/f

Ddah1HKO小鼠

病毒產品

AAV8-TBG-shS100a11

AAV8-GFP

病毒用量

1.1×10E12 vg/mouse

注射方式

尾靜脈注射

檢測時間

注射后4周

案例5- 心臟

文章標題:

KLF9 Aggravates Streptozotocin-Induced Diabetic?Cardiomyopathy by Inhibiting PPARγ/NRF2 Signalling

發表期刊:

Cells(IF?7.666)

合作客戶:

徐州醫科大學附屬醫院縱靜/錢文浩研究團隊

基因信息

轉錄因子KLF9

實驗動物

18周齡雄性C57BL/6J小鼠

病毒產品

AAV9-cTnT-shKLF9

AAV9-shNC

病毒用量

60 μL,6.5–7.5×10E13 GC/mL

per mouse

注射方式

眶后靜脈叢注射

案例6- 心臟

文章標題:

NKRF in Cardiac Fibroblasts Protects against Cardiac Remodeling Post-Myocardial Infarction via Human Antigen R

發表期刊:

Advanced Science(IF?15.1)

合作客戶:

山東大學齊魯醫院張澄/張猛/孔靜團隊

基因信息

人抗原R-HuR

實驗動物

8周齡雄性NKRF-CKO小鼠

病毒產品

AAV9-FSP1-shHuR

病毒用量

2.8×10E11 vg /mouse

注射方式

尾靜脈注射

案例7- 胰腺

文章標題:

Autotaxin signaling facilitates b cell dedifferentiation and dysfunction induced by Sirtuin 3 deficiency

發表期刊:

Molecular Metabolism (IF 8.568)

合作客戶:

香港中文大學 Alice P.S. Kong/田小雨教授研究團隊

基因信息

Atx:外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶(Enpp1-7)蛋白家族成員

實驗動物

8周齡雄性Sirt3?f/f?

Sirt3?f/f;Cre/+?小鼠

病毒產品

AAV8-insulin 1-shAtx

AAV8-scramble

病毒用量

1 x 10E12 genome copies

注射體積

100 μL病毒混懸液

注射方式

腹腔注射

案例8- 腎臟

文章標題:

Auto- and paracrine rewiring of NIX-mediated mitophagy by insulin-like growth factor-binding protein 7 in septic AKI escalates inflammation-coupling tubular damage

發表期刊:

Life Sciences(IF6.780)??

合作客戶:

浙江省人民醫院呼邦傳老師課題組

基因信息

NIX:線粒體膜蛋白基因

病毒產品

AAV9-KSP1.3-miR30-sh.NIX

AAV9-sh.scr

實驗動物

IGFBP-7?KO小鼠

注射方式

尾靜脈注射

病毒用量

100 μL,1×10E12 copies

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