RT-qPCR實驗包括RNA提取與質量評估，逆轉錄和qPCR三大步驟，細節繁多，容易“翻車“，那么如何才能完成一次成功的RT-qPCR實驗呢？接下來我們就來一起看下吧。

RNA質量評估

在RT-qPCR實驗中，RNA提取完成后，需要對RNA的質量進行評估，合格后才可進行后續實驗。評估方法有分光光度計，瓊脂糖凝膠電泳，Agilent 2100分析等，其中最常用的有分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳法檢測。我們需要注意的是這兩種方法需要搭配使用，才能完成對RNA濃度、純度和完整度的檢測分析，以保證RNA的質量。

分光光度計：

分光光度計主要用于測定RNA的濃度和純度，但不能對RNA的完整度和基因組殘留進行檢測。其中，A260/280和A260/230是RNA純度檢測的重要參數，可根據其數值的波動，檢測RNA的純度：

1、1.9< A260/280< 2.1，說明RNA純度較好；A260/280<1.9，表示RNA中可能有蛋白殘留；A260/280>2.1，表示RNA可能有部分降解，可經瓊脂糖凝膠電泳進一步確認。

2、2.0< A260/230< 2.2，說明RNA純度較好；A260/230< 2.0，則說明RNA中可能有機試劑殘留，如酚、乙醇或糖類等。

瓊脂糖凝膠電泳：

瓊脂糖凝膠電泳檢測可以分析RNA的完整度，基因組和蛋白殘留，但不能對RNA的濃度準確定量，也不能檢測有機試劑的殘留。以真核生物RNA模板為例：

1、 將RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，若膠圖上只有28sRNA、18sRNA和5.8sRNA三條單一的條帶，說明提取的RNA完整度良好。如果出現拖帶的現象，表示RNA部分降解。

2、若膠孔和28sRNA條帶之間出現單一明亮的條帶，表示可能有基因組DNA殘留。

3、若膠孔內出現條帶，說明可能有蛋白等大分子物質殘留。

逆轉錄

RNA提取完成后，需要反轉成cDNA才能進行后續實驗，所以反轉步驟是必不可少的。逆轉錄將從逆轉錄酶的選擇和引物的選擇進行介紹：

逆轉錄酶的選擇：

常見代表性反轉錄酶有AMV RTase和MMLV RTase兩大類：AMV RTase的RNase H活性強，合成長度短，合成量低，熱穩定性好（42～55℃）；MMLV RTase的RNase H活性弱，合成長度長，合成量高，熱穩定性差（37～42℃）。

由于RNase H酶具有降解RNA模板的功能，所以在逆轉錄時應該優先選擇RNase H活性弱的MMLV ，而且后期經過基因工程改造，MMLV熱穩定性已達到質的飛躍。以Arcegen的一鏈cDNA合成反轉錄預混液（含gDNA消化，用于qPCR）（N132061）為例，該酶經基因工程改造，刪除了RNase H活性，同時反應溫度可達60℃，針對高GC及富含復雜二級結構的模板具有更高的反轉錄效率。

引物的選擇：

通常RT primer可分為三類：oligo dT，隨機引物和基因特異性引物。根據不同的實驗需求選擇適合的引物進行使用。

1、如果模板為真核生物來源，且后期cDNA用于常規PCR擴增，建議選擇Oligo（dT）；若后續實驗僅用于qPCR，建議將Oligo（dT）與隨機引物混合后使用，可提高反轉錄效率。

2、如果模板為原核生物來源，反轉錄請選用Random Primers 或者基因特異性引物。

熒光定量

熒光定量主要從定量方法的選擇、引物設計原則、ROX的選擇、反應體系的配置和反應條件的設置等分別進行闡述：

定量方法的選擇：

定量方法分為相對定量和絕對定量。相對定量可用于檢測某種處理方法對基因表達的影響，檢測基因在不同時間的表達差異和比較基因在不同組織中的表達差異；絕對定量可對病毒中核酸的量進行檢測等。大家在做實驗時，一定要根據自己的實驗選擇合適的定量方法。

引物設計原則：

qPCR引物設計的好壞，直接關乎著擴增效率高低，產物特異性與否。所以正確設計出好的引物是qPCR成功的第一步。引物設計在滿足常規引物設計的原則上還要注意以下原則：

1、 目的片段長度控制在100 ~ 300 bp；

2、跨外顯子設計，避免基因組DNA的影響；

3、 設計的引物需要進行擴增效率的檢測，擴增效率達標（90-110%）才可用于定量實驗；

4、 引物濃度通常在0.1uM-1.0uM之間優化選擇。

ROX的選擇：

在定量反應過程中，ROX能夠均一化校正儀器的光程差，移液誤差或蒸發冷凝導致的體積差等，提高結果的重復性。但需要注意的是ROX的選擇與儀器相關，如果qPCR儀有自動校正孔間差的功能，就不需要添加ROX，反之則需要添加ROX校正。小伙伴們在買試劑時一定要根據所用的儀器型號選擇正確ROX，避免后期出錯。

反應體系的配制：

反應體積優先推薦20ul和50ul。體系配制時要注意以下事項：

1、 反應體系需要在超凈工作臺中通風配制；每次實驗都要用新的ddH₂O；

2、每次實驗都需要配制NTC來驗證體系中是否存在污染，配制體系時每一對引物都需要做NTC；

3、如果想檢測RNA模板是否有gDNA殘留，可將每個樣本都配制NRT進行檢測；

4、配制體系時，一個樣本建議至少做3個技術型重復；

5、模板為cDNA時，建議稀釋5-10倍，減少反轉錄體系對qPCR實驗的抑制作用，模板量最好進行梯度摸索，使CT值落在20-30之間最佳；

6、確定所需的反應數量，在反應數量的基礎上增加5-10%，計算體積配置數量；

7、體系配制采用能預混則預混原則，混勻后離心并保證無氣泡；

8、盡量選擇進口且配套的耗材，如ABI儀器最好使用ABI封板膜，伯樂儀器使用配套的白色陶瓷板子。

反應條件的設定：

不同的熒光定量酶可能反應條件不一樣。比如Arcegen的熒光定量酶就分為配體法熱啟動酶和抗體法熱啟動酶，關于這兩種酶反應條件的設定需要注意以下幾點：

1、設置程序時要注意配體法的預變性為95℃，5min；抗體法的預變性為95℃，30s。；

2、選擇兩步法，可保證產物高特異，選擇三步法可保證高效率擴增，小伙伴可根據自己的實驗選擇合適的程序；

3、上機時盡量避免使用最外面一圈的孔。

以上就是對RT-qPCR注意事項的詳細總結，希望能夠對大家的實驗有所幫助。

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