VEGF-B是VEGF-A的同源物，在血管內皮細胞(ECs)和許多其他細胞類型中高度表達。不同的研究報道了VEGF-B的各種作用，但其在血管系統中的具體作用仍不甚明了。2023年8月18日，中山大學中山眼科中心李旭日教授，瑞典卡羅林斯卡研究院曹義海教授聯合復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院趙晨教授在“Signal Transduction and Targeted Therapy,IF 39.3”上發表了題為VEGF-B prevents excessive angiogenesis by inhibiting FGF2/FGFR1 pathway的研究論文。文章首次闡明VEGF-B結合FGFR1，誘導FGFR1/VEGFR1復合物的形成，從而抑制FGF2/FGFR1介導的Erk激活、血管生成以及腫瘤生長，揭示了VEGF-B作為抗血管生成因子的新功能。
維真生物助力：腺病毒
基因信息
FGFR1，成纖維細胞生長因子受體（FGFR）家族成員
病毒產品
Ad-FGFR1 WT，Ad-FGFR1 Y463F,
Ad-FGFR1 Y585F，Ad-FGFR1 Y653F
感染細胞
HUVECs，人臍靜脈內皮細胞
MOI
10
感染時間
48h
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· 01 ·研究結果
1、VEGF-B與FGFR1特異性結合
作者利用人視網膜內皮細胞( HRECs )篩選了一個磷酸化受體酪氨酸激酶( pRTK )抗體陣列，發現VEGF-B可能與FGFR1相互作用；進一步檢測發現VEGF-B與FGFR1特異性結合。接下來，作者研究了VEGF-B結合的FGFR1細胞外結構域，并生成了FGFR1不同細胞外結構域(D)的重組蛋白:FGFR1 DI、DII、DIII、DI-II和DII-III。利用過表達FGFR1的人臍靜脈內皮細胞(HUVECs)的細胞遷移實驗驗證這些重組蛋白的功能，發現FGFR1 DII-III減少了FGF2誘導的細胞遷移，而FGFR1 DIII沒有。SPR分析和單結構域結合實驗均顯示VEGF-B與FGFR1 DIII和DII結合的KD值與FGF2相似，表明VEGF-B主要結合FGFR1結構域II和III。進一步研究發現VEGF-B與FGF2競爭FGFR1結合，并且VEGF-B可能通過競爭FGFR1結合來抑制FGF2的功能。
圖1. VEGF-B與FGFR1結合，并與FGF2競爭FGFR1結合
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2、VEGF-B誘導VEGFR1/FGFR1復合物形成
鑒于VEGF-B與VEGFR1和FGFR1結合，作者探討了VEGF-B是否可以誘導VEGFR1/FGFR1復合物的形成。IP和WB結果顯示，VEGFR1與FGFR1在小鼠腦、肺、心臟等組織中共免疫沉淀，證明存在天然的內源性VEGFR1/FGFR1復合物。重要的是，在小鼠眼睛玻璃體內注射VEGF-B會增加視網膜中VEGFR1/FGFR1復合物的數量，而用胎盤生長因子（PlGF）處理則沒有。為了直接觀察FGFR1/VEGFR1復合物，作者使用同時表達VEGFR1和FGFR1的HRECs進行了原位近距離連接實驗，發現VEGF-B處理增加了FGFR1與VEGFR1的關聯，而PlGF沒有，表明VEGF-B的作用是特異性的。體內和體外實驗表明，VEGF-B誘導FGFR1/VEGFR1復合物的形成。此外，VEGF-B以高親和力結合VEGFR1/FGFR1異源二聚體。
圖2. VEGF-B誘導VEGFR1/FGFR1復合物形成
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3、VEGF-B抑制FGF2誘導的Erk活化
為研究VEGF-B誘導的下游信號，作者使用不同類型的內皮細胞篩選了磷酸化激酶抗體陣列，發現VEGF-B降低了人皮膚微血管內皮細胞1（HMEC1）、HRECs和HUVECs中的Erk磷酸化，驗證發現VEGF-B的抑制作用是特異性的，VEGF-B對FGF2誘導的FGFR1激活的抑制作用在小鼠視網膜的體內也得到了證實。作者進一步用苯丙氨酸(F)分別代替FGFR1的六個酪氨酸(Y)，產生了一系列的定點突變。VEGF-B在表達野生型FGFR1 (WT-FGFR1)和FGFR1-F766, FGFR1-F654和FGFR1-F583突變體的細胞中抑制了FGF2誘導的Erk磷酸化，但在表達FGFR1-F463, FGFR1-F585和FGFR1-F653突變體的細胞中未發現該抑制作用，表明酪氨酸殘基Y463, Y585和Y653對VEGF-B的抑制作用很重要。利用腺病毒（維真助力）在HUVECs中過表達野生型FGFR1和Y463F, Y585F和Y653F突變體，結果發現VEGF-B在過表達FGFR1 WT的HUVECs中增加了VEGFR1/FGFR1復合物的形成，但在過表達FGFR1 Y463F、FGFR1 Y585F或FGFR1 Y653F突變體的HUVECs中沒有增加，表明酪氨酸殘基Y463、Y585和Y653在介導VEGF-B誘導的VEGFR1/FGFR1復合物形成中的作用。以上體內外數據均表明VEGF-B對FGF誘導的Erk活化具有抑制作用。
圖3. VEGF-B抑制FGF2誘導的Erk活化
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4、VEGF-B抑制FGF2驅動的血管生成和腫瘤生長
接下來，作者探究了VEGF-B是否影響FGF2的血管生成活性。體內皮下Matrigel實驗顯示，VEGF-B抑制了FGF2誘導的血管生成，而PlGF則沒有作用。利用表達高水平FGF2的小鼠T241纖維肉瘤細胞進一步驗證了VEGF-B抗血管生成作用的體內相關性，發現T241-FGF2細胞在VEGF-B?/?小鼠中形成了更大的腫瘤，腫瘤血管生成增加。綜上實驗結果表明VEGF-B對FGF2介導的功能有抑制作用。進一步驗證發現VEGFR1和FGFR1是VEGF-B發揮抑制作用所必需的。
圖4. VEGF-B抑制FGF2驅動的血管生成和腫瘤生長
· 02 ·小結
本研究發現VEGF家族成員VEGF-B在高FGF2/FGFR1水平的條件下，通過抑制FGF2/FGFR1途徑發揮抗血管生成因子的作用。在機制上，VEGF-B與FGFR1結合，誘導FGFR1/VEGFR1復合物形成，抑制FGF2誘導的Erk激活，從而抑制FGF2驅動的血管生成和腫瘤生長。本研究揭示了VEGF-B作為FGF2/FGFR1途徑內源性抑制劑的新功能。