小鼠小腸類器官作為一種體外模型，廣泛應用于腸道疾病研究、藥物篩選等領域。類器官構建細胞來源通常有原代細胞和干細胞兩種，由于小鼠腸道原代細胞來源廣泛、能夠更好地模擬體內真實情況、培養相對簡單，能夠滿足大多數研究和應用需求，因此，小鼠小腸類器官通常使用組織分離出的原代細胞構建。今天我們就來看看如何利用原代細胞構建小鼠小腸類器官。

材料準備

♦ 實驗動物：根據實驗要求選擇合適的小鼠品系。

♦ 實驗試劑：小鼠小腸類器官用培養基（可自行配制，也可直接購買），基質膠，DPBS，組織消化液等。

♦ 實驗耗材：無菌操作所需的培養皿、離心管、移液槍頭、24孔板等，以及用于細胞過濾的70μm細胞濾網。

實驗步驟

♦ 小腸組織取材

1. 小鼠處死后，表面噴灑酒精殺菌。在無菌環境下截取出近胃端處3-15cm腸組織，用鑷子小心去除腸道外部的腸系膜、脂肪，放入4℃預冷的含1%雙抗的DPBS溶液中。

2. 使用注射器沖洗腸道2-3次，用手術剪將腸管小心剪開，腸腔面朝上，用手術刀片輕輕刮去腸腔表面腸絨毛，待腸絨毛被刮凈后（呈現透明），將腸組織置于新的含DPBS的培養皿中清洗2-3次。

♦ 隱窩分離

1. 將清洗后的小腸組織剪碎至2mm寬大小，轉移至新的50ml離心管中，用DPBS小心清洗3-5次，除去腸絨毛細胞和漂浮脂肪組織。

2. 在清洗好的小腸碎片組織加入10-15ml含有3-5mM EDTA的預冷DPBS中消化，4℃孵育30min左右，其間每10min輕搖一次離心管。

3. 消化完成后，棄去EDTA消化液上清，用新的DPBS緩沖液將組織輕柔漂洗2-3次以去除剩余EDTA。

4. 在小腸組織碎片中加入10-15ml預冷的含0.1%BSA的DPBS，反復吹打、重懸，使隱窩與基底層分離，然后取少許懸液鏡檢，當看有大量隱窩樣結構后，停止吹打，并對吹打后的組織懸液使用70μm濾網過濾并收集穿過濾網的組織懸液。

5. 收集得到的組織懸液，1500rpm、4℃離心3min。

♦ 基質膠包埋與培養

1. 用基質膠重懸隱窩組織沉淀，使每10μL基質膠懸液包含200-600個隱窩，重懸后混合液置于冰上，盡快操作以避免基質膠凝固。

2.  將混合懸液種植于24孔板底部正中央，每孔30-50μL左右，不接觸孔板側壁。

3. 將種植后的培養板至于37℃二氧化碳恒溫培養箱中，孵育30min左右待基質膠凝固。

4. 待基質膠完全凝固后，沿壁緩慢加入小鼠腸類器官培養基，每孔800μL/孔。

5. 將24孔板置于37℃二氧化碳培養箱中培養。每3天更換一次新鮮培養基并監測類器官生長狀態（一般小鼠小腸類器官在5-7天內形成）。

小鼠小腸類器官不同天數生長情況

注意事項

♦ 無菌操作：整個構建過程需嚴格遵守無菌操作原則，避免污染。

♦ 溫度控制：基質膠操作需在冰上進行，避免其提前凝固；培養基在使用前需恢復至室溫。

♦ 操作輕柔：在分離隱窩和處理基質膠時，動作要輕柔，避免產生氣泡或破壞隱窩結構。

希望以上內容能夠幫助你順利構建小鼠小腸類器官，有問題歡迎大家留言討論哦。

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