機制復雜難定，治療藥物多樣多變，如何搶占制藥先機？
篩選領域再起風云，AD模型再次突破，整體治療多藥驗證！
摘要：杭州環特生物科技股份有限公司與浙江省醫學科學院藥物研究所聯合在《Journal of Pharmacy and Pharmacology》上發表文章，介紹了用斑馬魚模型快速篩選阿爾茲海默癥治療藥物的研究成果，該研究以斑馬魚整體行為學作為主要指標，用6種不同機制藥物（化合物）驗證了用斑馬魚模型快速篩選阿爾茲海默癥藥物的可靠性。
AD（阿爾茨海默?。┦且环N復雜的神經變性疾病，常常導致認知功能下降，是造成老年癡呆的主要原因。盡管有眾多的體外和體內實驗能證明AD疾病發生時伴有乙酰膽堿的水平降低、過氧化、金屬離子水平升高、Aβ（淀粉樣蛋白β）聚集等情況，但是AD的發病機制仍有待闡明。
為了篩選有效的抗AD藥物，能模擬AD病理過程的實驗動物模型是必不可少的。長期以來，小鼠篩選系統一直占著阿爾茨海默氏病研究中的主導地位。近年來，斑馬魚模型引起了學者的極大關注，并由于成本效益被廣泛使應用在實驗中。例如，帕凱等人開發出了一直tau蛋白的轉基因斑馬魚模型，用來定位tau蛋白磷酸化的化合物。而且斑馬魚模型能很好地識別出GSK3β抑制劑，如潛在AD靶向治療藥GSK3，就會導致斑馬魚胚胎腦部減小。然而，大多數的斑馬魚AD模型都是轉基因品種，需要極大的時間和金錢成本，因此新的且能快速篩選抗AD藥物的斑馬魚模型是及其有必要的。
氯化鋁是一種用于誘導嚙齒類AD模型的標準化學品，用氯化鋁可以減慢6-8個月的斑馬魚的游動速度，和AD患者的運動障礙現象十分相似，因此可以用氯化鋁來誘導制造新的斑馬魚AD模型。之所以選擇受精后3-5天的幼魚，而不是先前所述的6-8個月的成魚做實驗是為了更好地進行高通量藥物篩選并削減成本。以多奈哌齊（DPZ）為陽性藥在實驗中不斷地對三個條件，即氯化鋁暴露濃度、暴露周期和藥物治療濃度上對模型進行了優化后成功建模，并驗證了該模型的可靠性和可重復性（表2）。
用6種具有多種作用機制的，或上臨床或上市的AD治療藥物對模型進行了驗證，以光線的變化后的運動障礙恢復率（DRR）和反應能力（RE）為量化指標來評價藥效。結果表明，RE可以作為一個可靠和方便的測量指標來評估6個抗AD藥物；而DRR這一評價指標對利凡斯的明（Rivastigmine），硫黃素T（Thioflavine T，ThT），氟比洛芬（Flurbiprofen）和AM-117，但不能評價美金剛（Memantine）和羅格列酮（Rosiglitazone）。我們建議，新的斑馬魚AD模型可用于新型抗AD化合物的高通量初篩實用系統。
讓我們一起來看看每個藥物在斑馬魚上的不同處理結果吧！
利凡斯的明（Rivastigmine）——乙酰膽堿酯酶抑制劑
利凡斯的明是5種被批準用于AD治療的乙酰膽堿酯酶抑制劑中的一種，也是世界上最暢銷的抗AD藥物之一，并且在斑馬魚上發現其是6種藥物中有最高無明顯損害作用水平（NOAEL）且恢復速度較好（運動障礙恢復率 = 53.4-64.0％，P <0.005；反應能力=86.6-175.1％，P <0.0001）。
美金剛（Memantine）——N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑
除了乙酰膽堿酯酶抑制劑外的另一個批準上市的重要的抗AD藥物是美金剛，是N-甲基-D-天冬氨酸受體拮抗劑。美金剛可阻斷N-甲基-D-天冬氨酸受體，減少鈣溢流入神經元細胞而導致的死亡并減輕AD癥狀。分別用低中高三種濃度的美金剛處理后，斑馬魚的反應能力有明顯提升，但運動障礙恢復率沒有觀察到顯著變化。這一結果表明，在這個模型上運動障礙恢復率可能無法成為美金剛的指標，但是，反應能力可以被用作測量的參數靶向篩選抗AD藥物N-甲基D-篩選天冬氨酸受體藥物。
硫黃素T（Thioflavine T，ThT），氟比洛芬（Flurbiprofen）和羅格列酮（Rosiglitazone）
Aβ（淀粉樣蛋白β）在AD的發病機理中發揮著重要的作用，而增加IDE（胰島素降解酶）的水平會活化PPARγ受體進而促進Aβ在大腦中的降解。ThT是Aβ凝聚抑制劑，而氟比洛芬和羅格列酮，是被批準的非類固醇抗炎藥和降血糖藥，分別作為γ分泌酶抑制劑和PPARγ激動劑正處于臨床實驗中。
運動障礙恢復率不能評價羅格列酮可以通過羅格列酮的機理進行說明。羅格列酮是作用在Aβ降解階段的，在聚集和生成階段的后面。因此，要羅格列酮影響到運動障礙恢復率可能需要更長的時間。
值得注意的是，用10μM氟比洛芬處理的的所有斑馬魚都死了。這些結果表明，高濃度的γ分泌酶抑制劑和鋁離子可能對斑馬魚有毒副作用。另一個原因可能是由于γ分泌酶抑制劑的副作用，該治療會影響到關系神經細胞生長的Notch信號通路。這一結果和小鼠模型是一致的，因此可以用此模型篩選γ分泌酶抑制劑并用于抗AD藥物的篩選。
AM-117——乙酰膽堿酯酶抑制劑和親金屬螯合劑
有研究表明在AD患者中的金屬離子水平是健康個體的3-7倍，這表明大腦內金屬（鐵，銅，鋅）水平的降低可能有助于AD治療。此外，乙酰膽堿酯酶的抑制和金屬離子的減少可以形成對AD治療的協同效應，此外這兩類藥物還能通過不同的機制減少Aβ的凝聚。因此，AM-117，乙酰膽堿酯酶抑制劑和親金屬螯合劑，被設計為在我們的實驗室MTDL（多目標導向配體）（無發表數據）。這并不奇怪，我們的數據顯示，運動障礙恢復率測量是在對AM-117治療劑量依賴性增加。