編者按
人體腸道類器官(hIOs)由于具有自我更新和分化能力，可以模擬腸道的簡化結構和功能。因此，hIOs已成為研究人類腸道發育和功能特性的體外模型系統。然而，由于腸道干細胞來源的類器官結構不規則，且在可重復性和大規模培養的方面受到限制，因此不具有廣泛實用性。
標準化的腸道干細胞(ISCs)培養方法可為培養同質、規?；哪c類器官提供合理的解決方案，ISCs在體外可以迅速擴增，是最有前途的腸上皮再生移植細胞來源。因此體外培養的ISC可以作為模型系統來研究ISC生物學和基因編輯細胞來源，從而可以作為成功模擬人類腸道的正常生理和病理的體外模型。
氣液培養(ALI)在類器官培養方面日益增多，在氣液培養中，基態干細胞繁殖穩定，基因組不穩定，容易高效地分化為腸上皮細胞，更好的模擬體內腸道功能。將ISC與氣液培養相結合，穩定產生突出絨毛樣結構的2.5D腸上皮模型。該技術為研究人類ISC及其在再生醫學和疾病建模方面的潛在應用提供了強有力的工具。
2024年1月27日 ，韓國科技大學韓國生物科學和生物技術研究所（KRIBB）的Mi-Young Son研究團隊在Nature Communications（IF=16.6）上發表了最新研究成果，該研究建立了一種在新條件下擴增的人腸道干細胞(ISC)培養方法，結合在最低限度培養基中的氣液界面培養，使ISC3D-hIO分化為具有細胞多樣性、絨毛樣結構和屏障完整性的腸上皮，且ISC3D-hIO是基因編輯研究ISC生物學和腸道疾病移植的理想細胞源，可以為再生醫學和疾病建模提供了一種生物工具。
文章題目
Chemically-defned and scalable culture system for intestinal stem cells derived fromhuman intestinal organoids
雜志：Nature Communications（IF=16.6）
發表時間：2024.1.27
作者：Mi-Young Son等
單位：韓國科技大學韓國生物科學和生物技術研究所（KRIBB）
01、研究結果
1. 成功建立無需飼養層的人源ISC
為了建立一種獲得可持續培養ISCs的方法，研究者從人多能干細胞(hPSC)衍生的3D hIO中分離出ISC3D-hIO，并且測試了幾種類型的細胞外基質(ECM)來代替飼養層細胞，發現ISC3D-hIO與明膠或I型膠原相比，在涂有1%基質凝膠的表面上可以更有效地生長和增殖。
圖1
為了優化ISC3D-hIO分離和擴增的生長培養基，研究者們評估了先前報道的參與體外人類結腸隱窩維持的各種生長因子和調節因子的組合，發現在培養基中添加RSPO1、EGF和PGE2對于ISC3D-hIO培養是必不可少的，因此制定了化學培養成份確定的ISC3D-hIO培養基對細胞進行進一步培養。
圖2
2. 單細胞分辨率下ISC3D-hIO細胞組成分析
為驗證上一步分離擴增出來的細胞準確類型，以便于實驗的下一步進行。研究者們通過單細胞RNA測序(scRNA-seq)系統對ISC3D-hIO的細胞組成進行了分析。通過對上皮細胞標記物(EPCAM、CDH1)和間質細胞標記物(MFAP4、COL1A2、DCN)、細胞周期以及與胎兒ISC標記基因(LDHB、EIF3E、SOX9和SHH)的表達對比研究發現，研究者們提取出的 ISC3D-hIO細胞主要由干細胞和祖細胞組成，且分化的細胞相對較少。
圖3
3. 采用氣液界面(ALI)培養向2.5D腸上皮分化
體外腸上皮培養物與體內的人腸組織形態功能相似，便于在體外進行腸道功能的分析和應用。在Transwell中將ISC3D-hIO進行ALI培養，使其分化為具有絨毛樣突出結構的腸上皮，建立具有人腸道結構和細胞多樣性等特性的體外培養模型。
在特定的營養條件下，ISC3D-hIO所表達的分化標志物表達逐漸提升，且衍生的上皮形成絨毛圖案，HE染色切片顯示，隨著ALI培養時間的延長，絨毛樣皺襞的厚度顯著增加，最終形成完整的上皮。通過分析ISC3D-hIO和ALI條件下培養的ISC3D-hIO細胞的相關成熟分化的RNA-seq數據，對比發現在ALI條件下，ISC3D-hIO具有分化為功能性腸上皮的能力，且分化程度高于正常條件下培養的ISC3D-hIO。
圖4
4. ISC3D-hIO在基因編輯和移植中的應用
ISC3D-hIO生長迅速，在可控的條件下進行培養，適合用于各種應用研究。為了研究新模型的適用范圍，研究者們使用慢病毒基因轉導來創建轉基因ISC3D-hIO細胞系。對基因轉導之后的細胞進行篩選，并通過ALI培養可以順利分化為可以被標記的3D hIOs和2.5D腸上皮模型，結果表明，ISC3D-hIO可以應用于基因組編輯技術構建穩定的細胞系。
圖5
為進一步研究腸上皮模型的應用價值，研究者們將ISC3D - hIO移植到EDTA損傷的NOD/SCID缺失IL2Rg基因(NIG)小鼠的結腸上皮中，觀察2周以評估其再生潛力。結果顯示，ISC3D-hIO移植組在原位表現活躍，腸道重量以及損傷程度均有改善，在植入部位有隱窩結構形成。表明ISC3D-hIO是一種可植入的組織再生來源，能夠形成腸上皮結構。
圖6
5. 嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (SARS-CoV-2)感染ali分化腸上皮的模型研究
為證明ALI培養產生的2.5D腸上皮是模擬宿主-病原體相互作用關鍵方面的合適模型，因此研究者們試圖使用2.5D腸上皮生成SARS-CoV-2病毒感染模型。
結果顯示，每個ISC3D-hIO保留了其起源hIO的腸道成熟特異性基因表達圖譜，ISC3D -成熟的hIO腸上皮比ISC3D -控制的hIO腸上皮更容易受到病毒感染，而且當使用可以破壞ACE2與SARS-CoV-2相互作用的化學藥物治療時，前者的受病毒感染情況得到更多的改善。因此，2.5D腸上皮模型，更適合研究宿主-病原體之間的相互作用。
圖7
02、編者點評
綜上，本研究開發了一種源于3D人腸腸道類器官（3D-hIO）的2D單層人ISC培養技術，在化學成分完全確定和無滋養層細胞的情況下，細胞主要由干細胞和前體細胞組成，R-spondin 1（RSPO1）、表皮生長因子（EGF）和前列腺素E2（PGE2）補充劑對細胞存活和增殖至關重要。該技術為研究人類ISC以及在再生醫學和疾病建模中的潛在應用提供了強大工具。
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