類器官是在體外使用干細胞、祖細胞、腫瘤細胞等培養的三維細胞結構，具有空間有序的組織結構，類似于某些組織。2021年，類器官技術被列為中國“十四五”規劃的重點研發方向之一。作為疾病模型，類器官相比傳統的2D疾病模型提供了一個更加生理相關的環境，有助于闡明疾病的進展、穩態、發病機制等方面。它們有望在細胞治療、藥物開發、遺傳工程、免疫學、組織再生等多個領域發揮重要作用。

圖：類器官的應用指南

類器官主要是在適宜的培養條件下，由成體干細胞或腫瘤樣本體外培養構建的。類器官的培養系統包括組織消化、清洗、處理、培養基準備、細胞與基質凝膠混合、培養、觀察等步驟。其中，細胞懸浮液與細胞外基質（基質凝膠）的混合是關鍵步驟之一，為類器官提供了三維生長的基質。

基質凝膠的主要成分包括層粘連蛋白、IV型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白多糖（HSPG）、nidogen，以及TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活劑等生長因子，這些生長因子在EHS腫瘤中天然存在。它為組織和細胞提供了支持、拉伸強度和支架支持。由Arcegen Biology開發和生產的Arcegel Matrix Gel不含LDEV（乳酸脫氫酶升高病毒），內毒素含量超低，并且經過徹底的支原體檢測以確保無污染，包括不同類型如基礎濃度、高濃度、低生長因子濃度等的基質膠。
 

應用方向

 小鼠小腸類器官構建

實驗步驟

1. 樣本準備：通過頸椎脫位法對小鼠實施安樂死，表面用酒精噴灑消毒。在無菌條件下，使用鑷子摘除位于胃近端3~15厘米長度的腸組織，仔細去除腸系膜和脂肪。將摘除的組織放入含有1%抗生素、預冷至4°C的DPBS溶液中。

2. 樣本清洗：使用注射器將腸管沖洗2-3次，然后用手術剪刀小心打開腸管，使粘膜面朝上露出腔面。用手術刀輕輕刮除粘膜表面的腸絨毛，直至組織變得透明。然后在新的含有DPBS的培養皿中再沖洗2~3次。

3. 初始樣本處理：將洗凈的小腸組織切成約2毫米寬的小片，轉移到新的50毫升離心管中。用DPBS輕輕沖洗組織3-5次，以去除腸絨毛細胞和漂浮的脂肪組織。

4. 樣本消化：將洗凈的小腸組織碎片在含有3-5mM EDTA的預冷DPBS中消化，在4°C下搖動約30分鐘。在孵化期間每10分鐘輕輕搖動離心管。

5. 消化后，倒掉含有EDTA消化液的上清液，用新鮮的DPBS輕輕沖洗組織2~3次，以去除殘留的EDTA。

6. 在小腸組織碎片中加入10~15毫升含有0.1% BSA的預冷DPBS。通過反復移液和懸浮將隱窩從基底層分離。在顯微鏡下檢查少量懸浮液，當觀察到大量隱窩樣結構時停止移液。將移液后的組織懸浮液通過70μm濾網過濾，收集過濾后的組織懸浮液。

7. 重復步驟5-6兩次，以1500轉/分鐘的速度在4°C下離心3分鐘。

8. 混合物形成：在Arcegel基質膠中重新懸浮隱窩組織沉淀。每10μL基質膠懸浮液中含有200~600個隱窩。懸浮后將混合物放在冰上，并盡快處理以避免凝膠形成。注意：基質膠的稀釋比例應≥50%，以確保培養過程中Arcegel基質膠結構的穩定性。

9. 將混合懸浮液種植在24孔板底部中心，每個孔約30~50μL，避免懸浮液與板壁接觸。

10. 將培養板放入37°C的二氧化碳培養箱中培養約30分鐘，直到基質膠固化。

11. Arcegel基質膠完全固化后，沿孔壁慢慢加入預先準備好的腸道類器官培養基，每個孔800μL。

12. 將24孔板放入37°C的二氧化碳培養箱中。每3天更換一次新鮮培養基，并監測類器官的生長狀況。通常，小鼠小腸類器官在5~7天內形成。
 

實驗結果

                      Day0                                                         Day3

                      Day5                                                          Day7

圖：小鼠小腸類器官的體外培養結果

常見問題解答

1. 組織消化應該使用哪種消化液，消化時間應該是多長？
組織消化可以使用EDTA或膠原酶。EDTA適用于小腸和胃等空腔器官，而膠原酶有多種類型，可以與DNA酶聯合使用，適用于更廣泛的組織類型。消化時間根據組織類型而有很大差異，從幾分鐘到幾個小時不等。

2. 處理基質凝膠時應采取哪些預防措施？
所有操作都應在無菌條件下進行，使用預冷的移液槍頭以確?；|凝膠處于均勻狀態。

3. 基質凝膠應如何分裝、冷凍和使用？
解凍后的Arcegel基質凝膠可以分裝到多個小管中，這些管子應該預先冷卻。分裝后應迅速冷凍并儲存，以避免反復凍融。

4. 在不同孔板中培養類器官需要多少體積的基質凝膠和培養基？
培養類器官通常使用24孔板，每個孔使用50μl基質凝膠，然后加入500-800μl培養基以覆蓋凝膠滴。在96孔板中，每個孔使用10μl基質凝膠，然后加入200μl培養基。對于6孔板，每個孔可以種植多個50μl的凝膠滴，然后加入2-3ml培養基以覆蓋凝膠滴。
 

相關產品