類器官（Organoids）是由干細胞或多能干細胞培養分化而形成的三維結構，能夠在一定程度上模擬真實器官的結構和功能。判斷類器官是否成熟并且在適當的時候進行傳代是確保類器官實驗能夠正常進行的關鍵，今天我們就給大家分享下如何判斷類器官是否成熟以及類器官的傳代流程。

一. 判斷類器官成熟的標志 

1 形態學觀察

大小和形狀：成熟的類器官通常大小均勻，形狀規則。不同類器官的形態特征不同，例如腸道類器官通常呈現囊狀結構，而腦類器官可能呈現神經球狀結構。

正常人體腸道類器官培養不同天數的形態，通常第12-14天可以進行傳代

結構復雜性：成熟的類器官應表現出與真實器官相似的分層或分區結構（如腸類器官的隱窩-絨毛結構、腦類器官的皮層樣分層等）。

以上均可通過鏡下觀察進行判斷。

2 細胞組成

細胞類型多樣性：成熟的類器官應包含多種細胞類型，例如腸類器官中應包含腸上皮細胞、杯狀細胞、潘氏細胞等。可通過免疫熒光染色或流式細胞術檢測特定細胞標志物（如Lgr5+干細胞、MUC2+杯狀細胞）來判斷。

(A) 腸道類器官組織學H&E染色；(B)免疫組化顯示腸組織中產生MUC2的杯狀細胞（紅色）

圖片來源：doi:10.14573/altex.1908311s

細胞分化程度：成熟的類器官中細胞應完成分化，表達成熟細胞標志物（如腸類器官中的Villin、腦類器官中的NeuN等），可采用蛋白質免疫印跡（WB）檢測其是否表達預期的Biomarker。

3 功能檢測

分泌功能：檢測類器官是否具有分泌功能（如腸類器官分泌黏液、胰腺類器官分泌胰島素）。

電生理活性：對于神經類器官，可通過膜片鉗等技術檢測神經元的電生理活性。

代謝活性：檢測類器官的代謝活性（如ATP生成、氧氣消耗率）。

預期功能：檢測其是否具有預期功能，例如腸類器官細胞 CFTR 活性功能檢測、心臟類器官是否可以自主跳動等。

4 基因表達分析

qPCR或RNA測序：檢測類器官中與成熟相關的基因表達水平（如腸類器官中的分化標志物、腦類器官中的神經元特異性基因）。

表觀遺傳狀態：檢測類器官的DNA甲基化或染色質狀態，判斷其是否接近體內成熟組織。

二. 類器官傳代流程 

1 判斷何時進行傳代

類器官生長速率：當類器官直徑達到200-500 μm時或類器官生長速度明顯減慢時，通常需要傳代。

培養基消耗：如果培養基變黃，說明需要傳代。

類器官結構變化：如果類器官結構開始變得不規則或出現中心壞死，應盡快傳代。

2 傳代步驟

收集類器官：用移液器輕輕吹打培養基，將類器官從基質膠中釋放出來。將類器官轉移至離心管中。

消化類器官：加入適量的消化酶，輕輕吹打類器官，使其解離成小細胞團或單細胞。消化時間根據類器官類型和消化酶濃度調整，通常為5-15分鐘。

終止消化：加入含血清的培養基終止消化反應。用移液器輕輕吹打，使細胞團分散均勻。

離心和重懸：以300-500 g離心5分鐘，棄上清。用新鮮培養基重懸細胞團。

重新接種：將細胞團與基質膠混合，接種到預熱的培養板中。待基質膠凝固后，加入類器官培養基。

培養：將培養板放回37°C、5% CO?培養箱中繼續培養。

注意事項：

1.消化時間控制：消化時間過長可能導致細胞損傷，過短可能導致類器官解離不完全。

2.基質膠品質：使用高品質的基質膠，確保其均勻分布。

3.培養基優化：根據類器官類型選擇合適的培養基成分（如Wnt、R-spondin、EGF等生長因子），確保類器官能夠正常分化。

4.污染防控：嚴格無菌操作，避免類器官污染。

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