一、實驗步驟

1、收集指數生長期、密度在80-90%的細胞，至無菌離心管中。

注意：細胞應在指數生長階段收集，細胞狀態極大影響細胞系移植的活力。如果細胞系異種移植的腫瘤活力差，則可以將Matrigel用作注射混合物，為植入提供豐富的基質環境。

2、細胞在4℃，1500rpm離心5min，去除上清液并將細胞均勻重懸于1mL PBS中，離心清洗2~3遍。使用胰酶消化細胞。加入PBS或無血清培養基制成細胞懸液，離心清洗1~2次去除胰酶，重懸至終濃度為1-5×10⁸個細胞/mL，置于冰盒中。

注意：確保細胞懸液均勻混合以獲得準確的細胞計數。細胞消化后應盡快接種到裸鼠皮下，一般盡量在半小時內完成（如果接種量大，可以分批接種）。

3、將細胞懸液和基質膠在4℃環境下按1:1比例進行稀釋，制備成終濃度為1-5×10⁷個細胞/mL，置于冰盒中。在接種前，使用槍將細胞懸液充分吹散，以確保細胞均勻分散，防止細胞聚集并降低其存活率。

注意：將細胞懸液放在冰上降低細胞的代謝以保持細胞的活性及防止出現凝膠現象。

4、皮下瘤接種體積為100-200μL，種植部位為血供豐富區域，如腋窩中后部、腹股溝中上部。接種時，用拇指和食指抓住肩膀上的皮膚，防止小鼠將注射器踢開，將動物保持在直立位置。用75%乙醇棉球輕輕消毒背部皮膚2-3次。

5、輕輕地將針插入背側的皮膚以到達皮下袋，避免下面的肌肉層。輕輕推入注射器中的細胞，在拔出針頭之前停留幾秒鐘，以防細胞懸液漏出。

注意：注射前，一定要排去針管內的空氣。在接種時，針頭應深入皮下約1厘米，以減少注射后細胞懸液從針眼溢出的可能性。注射時，針頭應向前方穿行，且在注射前輕微移動針頭，以確保針頭處于皮下。如果針頭能夠移動，則表明它在皮下位置，否則可能在皮內或肌肉內。

6、將裸鼠放回籠內繼續飼養，每天監測裸鼠的存活和腫瘤生長的體積，同時觀察小鼠的精神狀態、體重、飲食情況。大約1周-1月左右可看到腫瘤出現，并根據實驗設計在腫瘤體積不超過1000mm³前對裸鼠進行安樂死，并拍照。

注意：在避免腫瘤過大（>1500 mm3）導致動物過度負擔。

7、取下瘤子后，將一部分凍存于液氮中，以備將來提取蛋白質和RNA使用；另一部分則用福爾馬林固定，用于免疫組化、免疫熒光等實驗。

二、注意事項

1、細胞

1）細胞系特性

不同細胞株的成瘤快慢會有差異，建議正式實驗之前開展預實驗，摸索細胞株成瘤性，同時參考已發文獻。

2）細胞狀態

細胞培養操作過程要注意防止污染。支原體污染極為常見，會改變培養細胞的代謝、增殖特征及形態等，從而影響腫瘤生長和結果的可重復性。建議接種前對細胞進行支原體檢測。

細胞活力是影響腫瘤形成的重要原因，接種細胞建議取處于對數期生長的細胞，接種前對細胞活率進行檢測，接種過程中細胞置于冰上，保持低溫，接種完成后也可以留一小部分細胞檢測細胞活率，確保接種過程中細胞活率沒有明顯降低。另外，注意避免體外過度傳代影響細胞狀態（一般3-5代）。

2、動物

常用的免疫缺陷小鼠品系有：裸鼠、NOD-Scid、NCG等。不同免疫缺陷程度的小鼠或小鼠不同周齡的成瘤速度有所差異，建議根據預實驗結果選擇合適的動物模型，同時參考已發表的文獻。選擇小鼠周齡不宜過大，如，裸鼠8周齡以上NK細胞等免疫細胞活力開始增強，一般來說，4～6周齡的裸鼠更容易成瘤，這時免疫系統不夠強，成瘤率相對較高。

3、接種部位

皮下注射主要有4個位點（如下圖所示），建議根據細胞株成瘤性和實驗目的選擇合適的接種部位。一般認為腋下皮下（3號位）血供充足，利于腫瘤細胞增殖，且右側操作較方便。如果個別瘤種生長速度較快，可以接種后肢或背部等供血量不是特別充足的地方，或者降低細胞接種劑量，減緩腫瘤生長速度。

4、接種量

不同的細胞系、不同的小鼠和接種位置所需要的細胞劑量會有差異，建議正式實驗之前開展預實驗，接種量設置多個梯度，摸索出最佳細胞注射劑量。

另外，可以根據細胞株類型選擇實驗中是否需要添加輔助因子，常規腫瘤細胞按1:1添加基質膠即可，卵巢癌一般均會加雌激素，接種細胞后單獨注射雌激素。

5、飼養管理

小鼠在運輸過程中會產生應激反應，使小鼠出現一系列的病理生理學變化，這些變化會增加某些實驗誤差，因此在接到動物后應盡量避免立即進行實驗，建議讓動物有1~2周的適應期。保持飼養環境的專業，免疫缺陷小鼠必須飼養在SPF級屏障設施內，且與免疫正常小鼠飼養在不同房間；裸鼠長期暴露在弱抗原的刺激下，NK細胞等免疫細胞的活力逐步增強，會導致裸鼠對腫瘤的非特異性免疫力增強；NCG及NCG相關背景品系是重度免疫缺陷模型，對病原體易感，飼養環境應清潔消毒到位。

三、產品推薦