01研究背景
脊髓損傷(SCI)是一種常見且嚴重的中樞神經系統損傷，可導致損傷平面以下神經功能障礙，誘導多能干細胞（iPSCs)可以個性化分化為神經干細胞(NSCs)，從而有效地為SCI提供移植細胞來源。近期，中南大學湘雅醫院、中國科學院遺傳與發育生物學研究所聯合北京藥理學與毒理學研究所在Cell Death & Bioactive Materials (IF 18.9) 上發表文章“Construction of functional neural network tissue combining CBD-NT3-modified linear-ordered collagen scaffold and TrkC-modified iPSC-derived neural stem cells for spinal cord injury repair”，基于TrkC修飾的iPSC衍生的NSCs和CBD-NT3修飾的線性有序膠原支架(LOCS)設計了功能性神經網絡組織，并證實移植該組織可再生神經元和突觸，改善損傷區域的微環境，增強細胞外基質的重塑，促進脊髓損傷模型大鼠后肢功能恢復。
02 結果展示
1. 基于LOCS和iPSCs構建功能神經網絡組織
為了進一步探討CBD-NT3和TrkC對體外功能神經網絡組織構建的影響，作者設計了未經CBD-NT3修飾的LOCS和未過表達TrkC的iPSC-NSCs作為對照組。使用Lv-TrkC（維真生物提供）轉染iPSCs，然后誘導其分化為NSCs，將CBD-NT3與LOCS孵育后，發現CBD-NT3能均勻地結合在LOCS上。為了確定CBD-NT3是否能與細胞膜上的TrkC結合，作者將CBD-NT3與細胞孵育，觀察到NT3和TrkC的共定位，Western Blot發現，與未經CDB-NT3處理的iPSC-NSCs-TrkC細胞相比，CDB-NT3處理導致細胞中TrkC的磷酸化水平顯著升高，表明CBD-NT3可以結合細胞表面表達的TrkC并激活NT3/TrkC。作者在CBD-NT3修飾的LOCS上接種iPS-NSCs- TrkC構建功能神經網絡組織，發現CBD-NT3修飾的LOCS可促進iPS-NSCs-TrkC的存活和增殖。
圖1 基于LOCS和iPSCs的功能神經網絡組織構建
2. CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs構建了功能神經網絡
作者發現LOCS+NT3+NSC-TrkC組表達膽堿能神經元標志物ChAT、谷氨酸能神經元標志物VGLUT1和成熟神經元標記MAP2的水平高于對照組，表明iPSC-NSCs-TrkC細胞在CBD-NT3修飾的LOCS中有分化為興奮性神經元的潛力。此外，在LOCS+NT3+NSC-TrkC組中檢測出更多的突觸素標記物SYN和突觸后密度標記物PSD95，表明LOCS+NT3+NSC-TrkC組在體外3D培養過程中具有更高的突觸形成潛力。作者還在LOCS+NT3+NSC-TrkC組中觀察到細胞已經分化，細胞表面出現軸突樣突起，細胞通過這些過程相互接觸，形成類似神經連接的網絡結構，表明CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs可以用來構建功能神經網絡組織。
圖2 CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs構建了功能神經網絡
3. 功能神經網絡組織移植促進脊髓損傷區神經元再生
作者構建全橫斷面SCI模型，研究功能性神經網絡移植對SCI的影響，發現功能性神經網絡組織移植可以顯著改善脊髓損傷區微環境，促進細胞外基質重塑。作者還測定了脊髓損傷區下行神經元的恢復情況，發現LOCS+NT3+NSC-TrkC組的5-HT陽性神經纖維遍及脊髓損傷區域，明顯優于其他對照組，說明功能性神經網絡組織植入脊髓損傷區可以建立損傷區與宿主脊髓之間的神經聯系，重塑下行神經元功能。ChAT和VGLUT1在LOCS+NT3+NSC-TrkC組的表達也更高，說明功能性神經網絡組織在促進興奮性神經元再生方面更有優勢。此外，LOCS+NT3+NSC-TrkC組在脊髓損傷區中央發現形態結構正常的神經元，并在LOCS周圍生長和延伸，表明移植組織與受傷部位建立了神經連接，并作為神經回路的中繼站。
圖3 功能神經網絡組織移植促進脊髓損傷區神經元再生
4. 功能神經網絡組織移植可改善脊髓損傷大鼠運動功能
作者在移植手術后評價了大鼠的后肢運動功能，發現LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠BBB評分優于其他組；斜網格攀爬結果證實，LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠后肢表現出明顯的自主運動，運動功能和協調能力均有明顯恢復。動物步態分析結果表明LOCS+NT3+NSC-TrkC組的大鼠恢復情況符合動物步態分析要求，停留強度曲線證實LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠的兩條后肢都能負重并在行走時移動。這些結果證實了LOCS支架移植可促進脊髓損傷大鼠后肢功能的恢復，基于CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs功能性神經網絡組織可以進一步顯著改善運動功能。
圖4 功能神經網絡組織移植可改善脊髓損傷大鼠運動功能
03實驗結論
本研究首次嘗試利用iPSc-NSCs作為種子細胞，基于受體和配體的相互作用構建功能性神經網絡組織，有效地為外源NSCs的個性化獲取提供了解決方案，拓展了iPSC-NSCs和LOCS在脊髓損傷修復研究中的應用前景，為脊髓損傷再生修復提供了一種新的生物材料設計思路。