01研究背景
脊髓損傷(SCI)是一種常見(jiàn)且嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，可導(dǎo)致?lián)p傷平面以下神經(jīng)功能障礙，誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs)可以個(gè)性化分化為神經(jīng)干細(xì)胞(NSCs)，從而有效地為SCI提供移植細(xì)胞來(lái)源。近期，中南大學(xué)湘雅醫(yī)院、中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所聯(lián)合北京藥理學(xué)與毒理學(xué)研究所在Cell Death & Bioactive Materials (IF 18.9) 上發(fā)表文章“Construction of functional neural network tissue combining CBD-NT3-modified linear-ordered collagen scaffold and TrkC-modified iPSC-derived neural stem cells for spinal cord injury repair”，基于TrkC修飾的iPSC衍生的NSCs和CBD-NT3修飾的線性有序膠原支架(LOCS)設(shè)計(jì)了功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織，并證實(shí)移植該組織可再生神經(jīng)元和突觸，改善損傷區(qū)域的微環(huán)境，增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)的重塑，促進(jìn)脊髓損傷模型大鼠后肢功能恢復(fù)。
02 結(jié)果展示
1. 基于LOCS和iPSCs構(gòu)建功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織
為了進(jìn)一步探討CBD-NT3和TrkC對(duì)體外功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織構(gòu)建的影響，作者設(shè)計(jì)了未經(jīng)CBD-NT3修飾的LOCS和未過(guò)表達(dá)TrkC的iPSC-NSCs作為對(duì)照組。使用Lv-TrkC（維真生物提供）轉(zhuǎn)染iPSCs，然后誘導(dǎo)其分化為NSCs，將CBD-NT3與LOCS孵育后，發(fā)現(xiàn)CBD-NT3能均勻地結(jié)合在LOCS上。為了確定CBD-NT3是否能與細(xì)胞膜上的TrkC結(jié)合，作者將CBD-NT3與細(xì)胞孵育，觀察到NT3和TrkC的共定位，Western Blot發(fā)現(xiàn)，與未經(jīng)CDB-NT3處理的iPSC-NSCs-TrkC細(xì)胞相比，CDB-NT3處理導(dǎo)致細(xì)胞中TrkC的磷酸化水平顯著升高，表明CBD-NT3可以結(jié)合細(xì)胞表面表達(dá)的TrkC并激活NT3/TrkC。作者在CBD-NT3修飾的LOCS上接種iPS-NSCs- TrkC構(gòu)建功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織，發(fā)現(xiàn)CBD-NT3修飾的LOCS可促進(jìn)iPS-NSCs-TrkC的存活和增殖。
圖1 基于LOCS和iPSCs的功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織構(gòu)建
2. CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs構(gòu)建了功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)
作者發(fā)現(xiàn)LOCS+NT3+NSC-TrkC組表達(dá)膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志物ChAT、谷氨酸能神經(jīng)元標(biāo)志物VGLUT1和成熟神經(jīng)元標(biāo)記MAP2的水平高于對(duì)照組，表明iPSC-NSCs-TrkC細(xì)胞在CBD-NT3修飾的LOCS中有分化為興奮性神經(jīng)元的潛力。此外，在LOCS+NT3+NSC-TrkC組中檢測(cè)出更多的突觸素標(biāo)記物SYN和突觸后密度標(biāo)記物PSD95，表明LOCS+NT3+NSC-TrkC組在體外3D培養(yǎng)過(guò)程中具有更高的突觸形成潛力。作者還在LOCS+NT3+NSC-TrkC組中觀察到細(xì)胞已經(jīng)分化，細(xì)胞表面出現(xiàn)軸突樣突起，細(xì)胞通過(guò)這些過(guò)程相互接觸，形成類似神經(jīng)連接的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，表明CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs可以用來(lái)構(gòu)建功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織。
圖2 CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs構(gòu)建了功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)
3. 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植促進(jìn)脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元再生
作者構(gòu)建全橫斷面SCI模型，研究功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)移植對(duì)SCI的影響，發(fā)現(xiàn)功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植可以顯著改善脊髓損傷區(qū)微環(huán)境，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑。作者還測(cè)定了脊髓損傷區(qū)下行神經(jīng)元的恢復(fù)情況，發(fā)現(xiàn)LOCS+NT3+NSC-TrkC組的5-HT陽(yáng)性神經(jīng)纖維遍及脊髓損傷區(qū)域，明顯優(yōu)于其他對(duì)照組，說(shuō)明功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織植入脊髓損傷區(qū)可以建立損傷區(qū)與宿主脊髓之間的神經(jīng)聯(lián)系，重塑下行神經(jīng)元功能。ChAT和VGLUT1在LOCS+NT3+NSC-TrkC組的表達(dá)也更高，說(shuō)明功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織在促進(jìn)興奮性神經(jīng)元再生方面更有優(yōu)勢(shì)。此外，LOCS+NT3+NSC-TrkC組在脊髓損傷區(qū)中央發(fā)現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)正常的神經(jīng)元，并在LOCS周圍生長(zhǎng)和延伸，表明移植組織與受傷部位建立了神經(jīng)連接，并作為神經(jīng)回路的中繼站。
圖3 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植促進(jìn)脊髓損傷區(qū)神經(jīng)元再生
4. 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植可改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能
作者在移植手術(shù)后評(píng)價(jià)了大鼠的后肢運(yùn)動(dòng)功能，發(fā)現(xiàn)LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠BBB評(píng)分優(yōu)于其他組；斜網(wǎng)格攀爬結(jié)果證實(shí)，LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠后肢表現(xiàn)出明顯的自主運(yùn)動(dòng)，運(yùn)動(dòng)功能和協(xié)調(diào)能力均有明顯恢復(fù)。動(dòng)物步態(tài)分析結(jié)果表明LOCS+NT3+NSC-TrkC組的大鼠恢復(fù)情況符合動(dòng)物步態(tài)分析要求，停留強(qiáng)度曲線證實(shí)LOCS+NT3+NSC-TrkC組大鼠的兩條后肢都能負(fù)重并在行走時(shí)移動(dòng)。這些結(jié)果證實(shí)了LOCS支架移植可促進(jìn)脊髓損傷大鼠后肢功能的恢復(fù)，基于CBD-NT3修飾的LOCS和TrkC修飾的iPSC-NSCs功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織可以進(jìn)一步顯著改善運(yùn)動(dòng)功能。
圖4 功能神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織移植可改善脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能
03實(shí)驗(yàn)結(jié)論
本研究首次嘗試?yán)胕PSc-NSCs作為種子細(xì)胞，基于受體和配體的相互作用構(gòu)建功能性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)組織，有效地為外源NSCs的個(gè)性化獲取提供了解決方案，拓展了iPSC-NSCs和LOCS在脊髓損傷修復(fù)研究中的應(yīng)用前景，為脊髓損傷再生修復(fù)提供了一種新的生物材料設(shè)計(jì)思路。