自噬（autophagy=self-eating）意為自體吞噬，是真核細胞在自噬相關基因（autophagy related gene，Atg）的調控下利用溶酶體降解自身細胞質蛋白和受損細胞器的過程。自噬可防止細胞損傷，促進細胞在營養缺乏的情況下存活，并對細胞毒性刺激作出反應。自噬包括生理條件下的基礎型自噬和應激條件下的誘導型自噬。前者是細胞的自我保護機制，有益于細胞的生長發育，保護細胞防止代謝應激和氧化損傷，對維持細胞內穩態以及細胞產物的合成、降解和循環再利用具有重要作用；但自噬過度可能導致代謝應激、降解細胞成分，甚至引起細胞死亡等。研究表明，自噬能在細胞穩態、衰老、免疫、腫瘤發生及神經退行性疾病等多種生理病理過程中發揮重要作用。

根據包裹物質及運送方式的不同可將自噬分為3種類型：

①巨自噬（macroautophagy）：通過形成具有雙層膜結構的自噬體（autophagosome）包裹胞內物質，最終自噬體與溶酶體融合。一般情況下所說的自噬是指巨自噬。

②微自噬（microautophagy）：通過溶酶體或液泡表面的形變直接吞沒特定的細胞器。

③分子伴侶介導的自噬（chaperone-mediated autophagy, CMA）：具有KEFRQ樣基序的蛋白在HSP70伴侶的幫助下，通過LAMP-2A轉運體轉運到溶酶體。

圖1. 3種自噬途徑

(Duraes Fernanda V et al. Front Immunol, 2015)

自噬的本質其實是細胞內的膜重排，其發生過程大體分為以下4個階段：自噬的起始→ 隔離膜和自噬體的形成→ 自噬體與溶酶體融合→ 自噬體的裂解（圖2）。

在自噬的發生過程中，有多種自噬相關蛋白可調節和控制自噬形成的不同階段。迄今為止，科學家已在酵母中鑒定出40余個編碼ATG蛋白的基因，并且大多數在酵母和哺乳動物之間高度保守。在哺乳動物細胞中，饑餓誘導的自噬大約受20種核心ATG基因調節，它們在液泡附近被不斷募集，并組裝形成自噬前體。這些基因的分類和作用（圖3）如下：

細胞基礎水平的自噬活性很低，不適于觀察，因此，對自噬研究多需人工干預。目前常用的自噬激動劑有Rapamycin和EBSS等，常用的自噬抑制劑有Chloroquine、3-MA、NH4Cl和 Bafilomycin A1等。這些自噬激動劑和抑制劑可以分別激活/抑制自噬發生的不同階段，可以根據實驗需要選擇合適的激動劑或抑制劑。更多自噬調控藥物見圖4。

在生理條件下，細胞自噬活性通常較低。但在饑餓、缺氧和疾病等刺激下會顯著上調。另外，自噬抑制也與某些疾病相關，如癌癥、神經退行性疾病等。選擇理想的檢測方法對于自噬研究至關重要。常用的觀察和檢測方法有∶

自噬體屬于亞細胞結構，普通光鏡下看不到，直接在透射電鏡下觀察自噬不同階段的形態變化是一種非常直接的方法。

LC3全稱MAP1LC3 ，貫穿整個自噬過程，是目前公認的自噬標記物。哺乳動物的LC3可分為三種：LC3A、LC3B和LC3C。其中，LC3B應用廣泛。

LC3蛋白合成后被Atg4剪切掉C端5肽，暴露甘氨酸殘基，產生胞漿定位的LC3-I。在自噬過程中，LC3-I會被包括Atg7和Atg3在內的泛素樣體系修飾和加工，與磷脂酰乙醇胺（PE）相偶聯，形成LC3-II并定位于自噬體內外膜上。自噬體和溶酶體融合后，外膜上的LC3-II被Atg4切割，產生LC3-I循環利用；內膜上的LC3-II被溶酶體酶降解，導致自噬溶酶體中LC3含量很低（圖6）。因此，可以通過熒光顯微鏡觀察內源性LC3或GFP-LC3，實現對自噬發生的檢測。

自噬形成時，GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3融合蛋白轉移至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色或黃色熒光斑點。當自噬溶酶體形成后，酸性環境使GFP熒光淬滅，而mCherry熒光不受影響，自噬溶酶體呈現紅色熒光（圖7）。因此，可以通過LC3熒光指示系統來監測自噬流。

① 利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化評價自噬形成（圖8）。自噬形成時，胞漿型LC3-I會酶解掉一小段多肽，隨后跟PE結合轉變為膜型的LC3-II。因此可以通過LC3-II/I比值的大小估計自噬水平的高低。

② 除LC3外，其他自噬底物表達量的變化也可以用于監測自噬流。其中，p62是研究廣泛的一個自噬底物。在自噬體形成過程中，p62作為鏈接LC3和聚泛素化蛋白之間的橋梁，被選擇性地包裹進自噬體，之后被自噬溶酶體中的蛋白水解酶將其降解（圖9），所以p62蛋白的表達量與自噬活性呈現負相關。因此，利用Western Blot檢測p62蛋白的表達量也可以評價自噬水平。