上期，我們為大家介紹了基因干擾的干貨知識以及維真特色shRNA干擾服務，小伙伴們有沒有收獲滿滿？然而，實踐才是檢驗真理的金標準，因此本期小V為大家整理了一些 維真生物 shRNA產品和服務成功應用的案例，和大家共同探討和學習！
01. 4in1 shRNA克隆案例分享
胃癌是侵襲性極強的惡性腫瘤之一，早期診斷率低，轉移率高。盡管胃癌在治療方面已經取得了一定的進展，但為了尋求更佳的治療手段，需要更好地了解其潛在發病機制和新的治療靶點。驅動蛋白超家族23基因（KIF23），在細胞質分離、軸突生長等多種細胞過程中發揮重要作用。目前，KIF23已被發現在多種腫瘤組織和細胞中高表達，提示KIF23與腫瘤發生有潛在的聯系。在本篇研究，作者發現KIF23的表達與胃癌的不良預后相關，且與腫瘤分期（pTNM）有關。體外實驗證明，KIF23的缺失對胃癌細胞的增殖有明顯的抑制作用。此外，KIF23基因敲除可顯著抑制小鼠胃癌細胞的增殖，并顯著下調腫瘤細胞增殖因子Ki67和PCNA的表達。綜上所述，這些數據表明KIF23可能是胃癌的一個潛在治療靶點。
產品：維真生物 4in1 shKIF23 質粒
轉染細胞：胃癌細胞系MGC-803和SGC-7901
KIF23 在人胃癌細胞MGC-803和SGC-7901中低表達(qPCR和WB)
02. shRNA腺病毒案例分享
據報道，跨膜蛋白173（TMEM173）重組蛋白能參與內質網應激、炎癥和免疫過程，這些過程都與心肌肥大密切相關。TMEM173和自噬之間有密切而復雜的聯系，但它在自噬中的具體作用還有待進一步研究。在本文中，作者發現與野生型C57BL/6小鼠相比，Tmem173基因敲除（KO）的小鼠在橫向主動脈縮窄（TAC）6周后表現出更嚴重的肥大、纖維化、炎性浸潤和心臟功能障礙。透射電鏡和蛋白質水平顯示KO小鼠心肌自噬小體降解受到抑制。另外，苯腎上腺素處理的乳鼠心肌細胞的體外實驗表明，Tmem173基因的豐度與Lc3-Ⅱ的豐度和反映自噬體降解能力的紅色和黃色熒光點數呈負相關。這些結果表明，TMEM173可以改善自噬通量，并對壓力超負荷所致的心肌肥厚具有保護作用，暗示其可能成為未來治療心肌肥厚的潛在靶點。
產品：維真生物 Ad‐shRNA‐Tmem173
感染細胞：乳鼠心肌細胞 NRCMs
MOI：20
Tmem173下調對體外PE誘導的心肌細胞肥大的影響
03. 4in1 shRNA腺病毒案例分享
破骨細胞是從單核/巨噬細胞系分化來的多核細胞，受核因子-κB受體激活因子配體( RANKL)調控，行使骨吸收的功能。過度的骨吸收會導致骨轉換失衡，并引發各種骨疾病。因此，探索破骨細胞骨吸收的新靶點或機制，可能有助于提高破骨細胞引起的骨疾病的治療效果，減少疾病副作用。先前研究已證明RANKL誘導的破骨細胞形成過程中，糖酵解代謝增強，但其發揮的具體作用尚不清楚。6-磷酸果糖-2激酶/果糖-2,6-二磷酸酶3 (PFKFB3)，是糖酵解的重要調節因子，華中科技大學同濟醫學院的研究人員通過對PFKFB3進行遺傳和藥理抑制，并利用去卵巢小鼠模型研究了PFKFB3在破骨細胞分化中及破骨細胞相關疾病發病機制中的作用，揭示了靶向PFKFB3阻斷糖酵解是一種潛在的治療破骨細胞相關疾病的策略。
產品： 維真生物 murine PFKFB3 Ad-4in1 shRNA
感染細胞：骨髓源性巨噬細胞BMMs
MOI：50
敲低PFKFB3的表達可降低成熟破骨細胞的數量大小且損壞F-肌動蛋白環
04. 4in1 shRNA慢病毒案例分享
雄激素受體AR在前列腺癌的發展和惡化中至關重要，通過前期研究作者發現，去泛素化酶-泛素特異性蛋白酶14（USP14）可以通過其去泛素化酶的活性穩定AR，促進前列腺癌的生長。近期，研究人員發現，AR在乳腺癌的發生發展中也能發揮關鍵作用。本篇文章主要探究去泛素化酶USP14對雄激素受體陽性乳腺癌發生發展的影響，該研究結果對當下以USP14為靶標治療AR乳腺癌新策略的觀點進行了有力支持。研究者通過shRNA慢病毒，敲低USP14的表達，然后檢測雄激素受體AR的表達，泛素化水平和降解速率，判定USP14是雄激素受體AR的去泛素化酶，穩定AR的水平，并通過進一步的的AR補救實驗判定USP14敲低或者抑制引起的乳腺癌細胞的生長抑制依賴于AR的水平。
產品： 維真生物 pLent-4in1 shUSP14-GFP
感染細胞：乳腺癌細胞株
用途：構建穩轉細胞株
在多種乳腺癌細胞中敲低USP14的表達
05. mir30-based shRNA AAV案例分享
恐懼和壓抑等情緒是我們生活中的正常生理和心理反應，但長期頻繁的急性情緒反應（又稱慢性應激）不僅會使腦神經可塑性發生變化，增加抑郁和焦慮風險，還會引起外周血T淋巴細胞功能障礙，造成免疫系統紊亂。目前的研究已經發現了多種免疫因子在心理疾病中的生理功能，然而，外周血T淋巴細胞在慢性應激誘導焦慮中的作用及其調控機制仍有待探索。浙江大學和東南大學研究團隊在《CELL》聯合發文，揭示了CD4+ T細胞嘌呤合成代謝紊亂與慢性應激誘導的焦慮行為之間的相互關聯，該成果對加深神經發育、精神疾病與免疫生理功能之間聯系的理解，對了解抑郁癥和焦慮癥的發病機制并開發新的治療藥物具有重要意義。
維真生物病毒產品：
①AAV9-GFAP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)
②AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(mAdora1)
③AAV8-MBP-GFP-miR30-shRNA(scramble)
注射部位：左側杏仁核
注射量：1x10E11 vg/mouse
流式細胞術分析顯示AAV病毒在左杏仁核少突膠質細胞中強烈、特異性表達
06. 誘導性shRNA AAV案例分享
抑郁癥是一種慢性復發性疾病，患病率呈逐年上升的趨勢，已成為世界疾病排行榜的第四大疾病。研究表明，炎癥和抑郁癥發生密切相關，長期精神壓力應激會使伏隔核(NAc)腦區緊密連接蛋白Cldn5（血腦屏障BBB的關鍵組分）表達下調，導致血腦屏障受損并促進抑郁樣行為。然而，血腦屏障損害為何僅出現在NAc，應激易感小鼠NAc腦區中緊密連接蛋白表達下調的分子機制尚不清楚。
伏隔核神經元cAMP調控血腦屏障完整性和抑郁敏感性
中國藥科大學的研究人員通過代謝組學分析等手段對壓力應激誘導抑郁的小鼠模型進行研究，發現cAMP在NAC中特異性降低，并與抑郁程度呈正相關，在NAC中補充cAMP可以改善BBB的完整性和抑郁樣行為。RNA-Seq分析發現，cAMP下降主要是因為其合成酶Adcy5受抑制，且此過程只發生在神經元細胞中。通過降低NAc中Adcy5的表達，內源性調節神經元內cAMP合成，可調節對社會應激的敏感性。此外，NAc腦區cAMP不足降低了胞外基質蛋白reelin的表達，外源補充后促進了BBB完整性，并改善了抑郁樣行為。上述結果表明，神經元cAMP可能通過Reelin介導的細胞外基質信號調節NAC血腦屏障完整性的分子機制，為抑郁癥的防治提供了新思路。
維真生物病毒產品：
①Dox 誘導性AAV2/9-shRNA-Adcy5（2.02x10E12 vg/mL）
②AAV2/9-shRNA（2.38x10E12 vg/mL）
注射部位：雙側伏隔核
注射方式：立體定向注射
注射量：每側0.5 μL
注射速率：0.1μL/min
伏隔核內神經元CAMP合成內源性調節后的行為變化
