編者按
肝臟是人體最大的實質(zhì)內(nèi)臟器官，參與多種過程，包括許多血漿蛋白的合成、維持恒定的血糖水平、新陳代謝、藥物解毒和酶的產(chǎn)生。然而，隨著經(jīng)濟的發(fā)展，肝臟相關(guān)的慢性疾病越來越多，并且藥物的肝毒性也引起了科研人員的重視，因此一個能夠高度模擬體內(nèi)環(huán)境的體外肝臟模型將大大促進這方面研究的進展。而來源于hiPSC的肝類器官模型，包含多種肝臟中的細胞類型，盡可能地模擬了人體內(nèi)肝臟的細胞結(jié)構(gòu)，大大助力了肝臟相關(guān)的疾病建模、遺傳研究和藥物篩選等研究。
今天，我們特別關(guān)注一項于2023年9月發(fā)表在《Experimental & Molecular Medicine》的經(jīng)典研究——Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human PSCs，該研究報告了一種用于生成血管化肝類器官的方法，并提出了誘導(dǎo)分化過程中的步驟，培養(yǎng)基配比以及細胞類型的鑒定方法等，為細胞治療、組織工程、藥物毒性評估和疾病建模等應(yīng)用提供了新的工具和平臺。
文章題目
Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human PSCs
雜志：Experimental & Molecular Medicine（IF=9.5）
發(fā)表時間：2023.9.1
作者：Sean P. Harrison, Richard Siller, Gareth .Sulivan等
01、研究背景
肝臟是人體最大的內(nèi)分泌器官，對維持體內(nèi)平衡至關(guān)重要，是異物代謝、凝血因子生成、氨清除以及其他多種基本功能的主要場所。對于肝衰竭，除了肝移植（LTX）外，沒有其他治療方法。此外，評估肝臟代謝和藥物毒性等的黃金標準是原代人類肝細胞（PHHs）。然而，PHHs 的供應(yīng)極為有限，而且在體外會迅速喪失功能。這一問題表明需要尋找潛在的替代品來填補這一空白，提供一個穩(wěn)定、可擴展和基因定義的替代方案。
在本文中，研究人員詳細的介紹了一種利用人類多能干細胞（hPSCs）構(gòu)建肝類器官的新方法。與傳統(tǒng)方法相比，該方法不需要2D形態(tài)構(gòu)建，不依賴于昂貴的生長因子和細胞外基質(zhì)，而是利用hPSCs在懸浮培養(yǎng)中自聚集形成3D結(jié)構(gòu)。所得的肝類器官具有類似肝臟的細胞組成和功能，包括肝臟特異性蛋白質(zhì)的產(chǎn)生和功能性。此外，這些器官樣結(jié)構(gòu)還可以用于研究凝血機制，并提供了一種潛在的細胞治療方法的基礎(chǔ)。
02、研究結(jié)果
1. 肝類器官誘導(dǎo)分化方案
hPSCs來源的多細胞肝類器官的分化過程，模擬了體內(nèi)發(fā)育的各個階段，如下圖所示：
圖1
2. iPSC來源的肝類器官的單細胞轉(zhuǎn)錄組分析
通過單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，研究人員對人類多能干細胞（hPSCs）來源的肝類器官進行了細胞多樣性的分析。他們發(fā)現(xiàn)了三個肝細胞聚類（HEP1-3），其中表達了甘油脂或膽固醇代謝基因。
進一步通過基因集富集分析發(fā)現(xiàn)，這些肝細胞聚類顯示出不同程度的門脈區(qū)基因特征富集，表明類器官中存在肝細胞基因表達的區(qū)域性差異。然而，相比于成熟的肝臟，這些肝類器官中的區(qū)域性基因表達水平較低，可能因為它們模擬了早期發(fā)育中的肝臟狀態(tài)。
圖2
3. iPSC來源的肝類器官的蛋白質(zhì)組學(xué)分析
研究人員通過分析發(fā)現(xiàn)在肝類器官和人類肝臟中存在相似的關(guān)鍵蛋白質(zhì)表達，涉及到血液凝固和氨基酸代謝等多種代謝途徑和功能。然后，通過無偏聚類分析，發(fā)現(xiàn)肝類器官和肝臟的蛋白質(zhì)表達模式存在顯著差異，特別是在與血液細胞相關(guān)的蛋白質(zhì)表達上。這項研究揭示了肝類器官的蛋白質(zhì)組學(xué)特征，為進一步理解其功能和應(yīng)用提供了重要參考。
圖3
4. iPSC來源的肝類器官含有肝實質(zhì)細胞
研究人員通過免疫熒光染色驗證了肝類器官的復(fù)雜性和成熟度，顯示了肝細胞的特征，包括谷氨酰胺合成酶（GS）、羧基安氨酸合酶（CPS1）和肝細胞核轉(zhuǎn)錄因子HNF4α的表達。這些標記物的存在表明肝類器官已經(jīng)超越了胎兒階段的發(fā)育，進入了更成熟的階段。
此外，還檢測到成人肝細胞和成熟標記物如CYP2A6和ASGR1的表達，進一步證實了肝類器官的成熟度。
圖4
5. iPSC來源的血管化肝類器官
研究人員通過單細胞RNA測序分析確定的內(nèi)皮細胞群，并使用CD31抗體驗證了肝類器官內(nèi)血管的存在。通過體積渲染的三維重建圖展示了具有中等直徑的血管腔，并且這些血管在尺寸上與毛細血管相符。
圖5
6. iPSC來源的肝類器官具有肝臟功能
研究人員發(fā)現(xiàn)人類誘導(dǎo)多能干細胞（iPSC）衍生的肝類器官具有類似于肝臟的轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達譜，并且展示了類似于肝臟的細胞組成。通過對其功能進行評估，發(fā)現(xiàn)這些肝類器官顯示出肝臟的功能，包括藥物代謝能力。
相比于二維培養(yǎng)中的肝細胞，這些肝類器官具有更高水平的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)的藥物代謝活性，并且在長期培養(yǎng)中保持了這種活性。這些發(fā)現(xiàn)為肝臟疾病建立模型以及開發(fā)新的藥物篩選平臺提供了潛在的工具。
圖6
7. iPSC來源的肝類器官分泌血漿蛋白，具有功能性凝血機制
研究人員對肝類器官進行了分析，證明其在轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組水平上表現(xiàn)出類似肝臟的特征，這些肝類器官不僅具有肝細胞特征，還顯示出肝細胞的極化特征，并且含有膽管細胞。此外，研究證實了這些肝臟類具有肝臟功能，如藥物代謝和血清蛋白的產(chǎn)生。通過RT-qPCR分析，發(fā)現(xiàn)了維生素K依賴性凝血因子、內(nèi)源性抗凝劑以及其他凝血因子的表達。
圖7
02、編者點評
總的來說，本文描述了一種能夠生成大量功能成熟的人類誘導(dǎo)多能干細胞（hPSC）來源的肝類器官的方法。該方法產(chǎn)生的肝類器官遵循肝臟類似的發(fā)育途徑，包含肝細胞和膽管細胞等肝樣細胞群，并且還包含非肝實質(zhì)細胞，如肝星狀細胞和內(nèi)皮細胞群等。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和免疫組化等方法驗證了這些肝類器官的肝樣特征。
此外，研究還觀察到肝類器官內(nèi)的血管化現(xiàn)象，并展示了其具有肝臟功能特征，包括產(chǎn)生血清蛋白、凝血因子和支持尿素生成等功能。研究還證明這些肝類器官可成功移植到小鼠體內(nèi)，并表現(xiàn)出人類白細胞介素CD31陽性內(nèi)皮結(jié)構(gòu)。這種大量生產(chǎn)的肝類器官將為疾病建模、了解再生過程以及潛在的治療手段提供有力工具。雖然目前存在一些挑戰(zhàn)，但這種方法有望成為臨床和篩選平臺的重要資源。未來，這些器官將有助于研究發(fā)育生物學(xué)、細胞相互作用以及毒性學(xué)和藥物篩選等領(lǐng)域。
這是一項非常值得閱讀的類器官研究，適合每一位想要開展“血管化肝類器官相關(guān)研究”的學(xué)者拜讀，文中提出了誘導(dǎo)分化過程中的步驟，培養(yǎng)基配比以及細胞類型的鑒定方法等。這項研究為細胞治療、組織工程、藥物毒性評估和疾病建模等應(yīng)用提供了新的工具和平臺。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實驗室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！