編者按
肝臟是人體最大的實質內臟器官，參與多種過程，包括許多血漿蛋白的合成、維持恒定的血糖水平、新陳代謝、藥物解毒和酶的產生。然而，隨著經濟的發展，肝臟相關的慢性疾病越來越多，并且藥物的肝毒性也引起了科研人員的重視，因此一個能夠高度模擬體內環境的體外肝臟模型將大大促進這方面研究的進展。而來源于hiPSC的肝類器官模型，包含多種肝臟中的細胞類型，盡可能地模擬了人體內肝臟的細胞結構，大大助力了肝臟相關的疾病建模、遺傳研究和藥物篩選等研究。
今天，我們特別關注一項于2023年9月發表在《Experimental & Molecular Medicine》的經典研究——Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human PSCs，該研究報告了一種用于生成血管化肝類器官的方法，并提出了誘導分化過程中的步驟，培養基配比以及細胞類型的鑒定方法等，為細胞治療、組織工程、藥物毒性評估和疾病建模等應用提供了新的工具和平臺。
文章題目
Scalable production of tissue-like vascularized liver organoids from human PSCs
雜志：Experimental & Molecular Medicine（IF=9.5）
發表時間：2023.9.1
作者：Sean P. Harrison, Richard Siller, Gareth .Sulivan等
01、研究背景
肝臟是人體最大的內分泌器官，對維持體內平衡至關重要，是異物代謝、凝血因子生成、氨清除以及其他多種基本功能的主要場所。對于肝衰竭，除了肝移植（LTX）外，沒有其他治療方法。此外，評估肝臟代謝和藥物毒性等的黃金標準是原代人類肝細胞（PHHs）。然而，PHHs 的供應極為有限，而且在體外會迅速喪失功能。這一問題表明需要尋找潛在的替代品來填補這一空白，提供一個穩定、可擴展和基因定義的替代方案。
在本文中，研究人員詳細的介紹了一種利用人類多能干細胞（hPSCs）構建肝類器官的新方法。與傳統方法相比，該方法不需要2D形態構建，不依賴于昂貴的生長因子和細胞外基質，而是利用hPSCs在懸浮培養中自聚集形成3D結構。所得的肝類器官具有類似肝臟的細胞組成和功能，包括肝臟特異性蛋白質的產生和功能性。此外，這些器官樣結構還可以用于研究凝血機制，并提供了一種潛在的細胞治療方法的基礎。
02、研究結果
1. 肝類器官誘導分化方案
hPSCs來源的多細胞肝類器官的分化過程，模擬了體內發育的各個階段，如下圖所示：
圖1
2. iPSC來源的肝類器官的單細胞轉錄組分析
通過單細胞轉錄組測序，研究人員對人類多能干細胞（hPSCs）來源的肝類器官進行了細胞多樣性的分析。他們發現了三個肝細胞聚類（HEP1-3），其中表達了甘油脂或膽固醇代謝基因。
進一步通過基因集富集分析發現，這些肝細胞聚類顯示出不同程度的門脈區基因特征富集，表明類器官中存在肝細胞基因表達的區域性差異。然而，相比于成熟的肝臟，這些肝類器官中的區域性基因表達水平較低，可能因為它們模擬了早期發育中的肝臟狀態。
圖2
3. iPSC來源的肝類器官的蛋白質組學分析
研究人員通過分析發現在肝類器官和人類肝臟中存在相似的關鍵蛋白質表達，涉及到血液凝固和氨基酸代謝等多種代謝途徑和功能。然后，通過無偏聚類分析，發現肝類器官和肝臟的蛋白質表達模式存在顯著差異，特別是在與血液細胞相關的蛋白質表達上。這項研究揭示了肝類器官的蛋白質組學特征，為進一步理解其功能和應用提供了重要參考。
圖3
4. iPSC來源的肝類器官含有肝實質細胞
研究人員通過免疫熒光染色驗證了肝類器官的復雜性和成熟度，顯示了肝細胞的特征，包括谷氨酰胺合成酶（GS）、羧基安氨酸合酶（CPS1）和肝細胞核轉錄因子HNF4α的表達。這些標記物的存在表明肝類器官已經超越了胎兒階段的發育，進入了更成熟的階段。
此外，還檢測到成人肝細胞和成熟標記物如CYP2A6和ASGR1的表達，進一步證實了肝類器官的成熟度。
圖4
5. iPSC來源的血管化肝類器官
研究人員通過單細胞RNA測序分析確定的內皮細胞群，并使用CD31抗體驗證了肝類器官內血管的存在。通過體積渲染的三維重建圖展示了具有中等直徑的血管腔，并且這些血管在尺寸上與毛細血管相符。
圖5
6. iPSC來源的肝類器官具有肝臟功能
研究人員發現人類誘導多能干細胞（iPSC）衍生的肝類器官具有類似于肝臟的轉錄和蛋白質表達譜，并且展示了類似于肝臟的細胞組成。通過對其功能進行評估，發現這些肝類器官顯示出肝臟的功能，包括藥物代謝能力。
相比于二維培養中的肝細胞，這些肝類器官具有更高水平的基礎和誘導的藥物代謝活性，并且在長期培養中保持了這種活性。這些發現為肝臟疾病建立模型以及開發新的藥物篩選平臺提供了潛在的工具。
圖6
7. iPSC來源的肝類器官分泌血漿蛋白，具有功能性凝血機制
研究人員對肝類器官進行了分析，證明其在轉錄組和蛋白質組水平上表現出類似肝臟的特征，這些肝類器官不僅具有肝細胞特征，還顯示出肝細胞的極化特征，并且含有膽管細胞。此外，研究證實了這些肝臟類具有肝臟功能，如藥物代謝和血清蛋白的產生。通過RT-qPCR分析，發現了維生素K依賴性凝血因子、內源性抗凝劑以及其他凝血因子的表達。
圖7
02、編者點評
總的來說，本文描述了一種能夠生成大量功能成熟的人類誘導多能干細胞（hPSC）來源的肝類器官的方法。該方法產生的肝類器官遵循肝臟類似的發育途徑，包含肝細胞和膽管細胞等肝樣細胞群，并且還包含非肝實質細胞，如肝星狀細胞和內皮細胞群等。通過轉錄組學、蛋白質組學和免疫組化等方法驗證了這些肝類器官的肝樣特征。
此外，研究還觀察到肝類器官內的血管化現象，并展示了其具有肝臟功能特征，包括產生血清蛋白、凝血因子和支持尿素生成等功能。研究還證明這些肝類器官可成功移植到小鼠體內，并表現出人類白細胞介素CD31陽性內皮結構。這種大量生產的肝類器官將為疾病建模、了解再生過程以及潛在的治療手段提供有力工具。雖然目前存在一些挑戰，但這種方法有望成為臨床和篩選平臺的重要資源。未來，這些器官將有助于研究發育生物學、細胞相互作用以及毒性學和藥物篩選等領域。
這是一項非常值得閱讀的類器官研究，適合每一位想要開展“血管化肝類器官相關研究”的學者拜讀，文中提出了誘導分化過程中的步驟，培養基配比以及細胞類型的鑒定方法等。這項研究為細胞治療、組織工程、藥物毒性評估和疾病建模等應用提供了新的工具和平臺。
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