螢光素酶報告基因檢測系統由于其特異性高、靈敏度強、操作簡便等優點，在基因表達調控、蛋白質相互作用、信號通路等研究領域具有廣泛應用。

而雙螢光素酶報告基因檢測系統，則是在單螢光素酶報告基因的基礎上，引入了“內參對照”報告基因，可以排除不同組之間細胞生長狀況、細胞數目以及轉染效率等帶來的干擾，使實驗結果更為可靠。

那么，雙螢光素酶報告基因與單螢光素酶報告基因檢測系統在操作上有何不同？該如何進行檢測？別急，今天小編就帶你一探究竟，讓你輕松掌握這個報告基因檢測的“神器”！

01 檢測原理

雙螢光素酶報告基因檢測系統含有兩種螢光素酶——螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla Luciferase），螢火蟲熒光素酶作為報告基因，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發出生物螢光；海腎熒光素酶作為內參基因，催化coelenterazine 氧化成coelenteramide，在coelenterazine 氧化的過程中，同樣也會發出生物螢光。通過酶標儀等測定反應過程中釋放的生物螢光，計算出兩種熒光讀值的比值，即可比較各組間螢光素酶活性差異，從而判斷基因表達情況。

02 檢測應用

microRNA研究：在報告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，用來檢測miRNA對于目的基因的調控（抑制作用），報告基因表達越少，說明miRNA的作用就越強。

轉錄調控研究：在報告基因的5'端加上待檢測基因的啟動子，用來檢測轉錄因子對啟動子的作用，啟動轉錄越多，那報告基因的表達量就越大，熒光值越高。

啟動子研究：將啟動子區域序列進行分段截短，或對特定位點進行突變，再分別構建到luciferase報告載體中，檢測其啟動子活性。

信號通路研究：信號通路的激活/監測基因的表達水平。

03 操作流程

質粒構建：雙螢光素酶報告基因系統一般將螢火蟲螢光素酶報告基因質粒和海腎螢光素酶報告基因質粒共轉染細胞，或將這兩個報告基因構建到同一個骨架質粒上（如pGL4質粒），分別用不同的啟動子啟動其表達。

細胞轉染：轉染方法選擇根據實驗目的選擇瞬時轉染和穩定轉染。對于短期表達的目的基因產物，可以選用瞬時轉染法，操作更為簡便。對于需要長期穩定表達目的基因產物，建議選用穩定轉染法，穩定性更好。主報告基因：內參報告基因轉染比例通常為10:1-100:1，啟動子和轉錄因子比例啟動子和轉錄因子比例一般為1:9。

04 報告基因檢測

檢測儀器：發光檢測儀（Luminometer），或帶有發光檢測模塊的多功能酶標儀。

發光模式：化學發光（Luminescence）。

檢測類別：終點法檢測。

波長范圍：無需設置波長，如需選擇，推薦全波長380-780 nm。注：只選擇在最大波長處檢測發光，過濾掉其他發光信號，意味著檢測會丟掉部分信號，損失靈敏度。

讀取模式：底讀或頂讀。

數據分析：通過酶標儀等儀器讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數值，兩種熒光值讀數不少于4位數，讀數大于8位數時，需要稀釋裂解上清（讀數與細胞種類、細胞狀態、轉染方法、轉染時間等因素相關）。

相對表達倍數具體計算公式：歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報告基因）/海腎螢光素酶讀值（內參基因）相對表達倍數=實驗組歸一化值/對照組歸一化值

怎么樣，看到這里大家有沒有掌握雙螢光素酶報告基因檢測的思路和方法呢？如果你還有其他問題，歡迎在評論區留言，和大家一起探討！

產品推薦

你試用，我送禮！——Arcegen精選產品，反饋“卡卡”獎

“卡卡”福利五步走（參與方式）：

1.關注公眾號；

2.進入公眾號，底部菜單，點擊“申請試用”；

3.收到產品，進行產品試用；

4.郵件反饋實驗結果；

5.發放京東卡。

活動規則：

(1)請務必根據試用反饋表要求，詳實填寫數據信息，技術人員將根據數據詳實度、豐富度等發放京東卡；

(2)每個ID限申請1份,僅限終端科研用戶；

(3)活動時間為2025年全年；

(4)京東卡發放時間為反饋數據收到后10個工作日內。