螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)由于其特異性高、靈敏度強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)，在基因表達(dá)調(diào)控、蛋白質(zhì)相互作用、信號(hào)通路等研究領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用。
而雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，則是在單螢光素酶報(bào)告基因的基礎(chǔ)上，引入了“內(nèi)參對(duì)照”報(bào)告基因，可以排除不同組之間細(xì)胞生長狀況、細(xì)胞數(shù)目以及轉(zhuǎn)染效率等帶來的干擾，使實(shí)驗(yàn)結(jié)果更為可靠。
那么，雙螢光素酶報(bào)告基因與單螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)在操作上有何不同？該如何進(jìn)行檢測(cè)？別急，今天小編就帶你一探究竟，讓你輕松掌握這個(gè)報(bào)告基因檢測(cè)的“神器”！
01 檢測(cè)原理
雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)含有兩種螢光素酶——螢火蟲螢光素酶（Firefly Luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla Luciferase），螢火蟲熒光素酶作為報(bào)告基因，催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會(huì)發(fā)出生物螢光；海腎熒光素酶作為內(nèi)參基因，催化coelenterazine 氧化成coelenteramide，在coelenterazine 氧化的過程中，同樣也會(huì)發(fā)出生物螢光。通過酶標(biāo)儀等測(cè)定反應(yīng)過程中釋放的生物螢光，計(jì)算出兩種熒光讀值的比值，即可比較各組間螢光素酶活性差異，從而判斷基因表達(dá)情況。
02 檢測(cè)應(yīng)用
microRNA研究：在報(bào)告基因的3'端加上目的基因的3'UTR，用來檢測(cè)miRNA對(duì)于目的基因的調(diào)控（抑制作用），報(bào)告基因表達(dá)越少，說明miRNA的作用就越強(qiáng)。
轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究：在報(bào)告基因的5'端加上待檢測(cè)基因的啟動(dòng)子，用來檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)啟動(dòng)子的作用，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄越多，那報(bào)告基因的表達(dá)量就越大，熒光值越高。
啟動(dòng)子研究：將啟動(dòng)子區(qū)域序列進(jìn)行分段截短，或?qū)μ囟ㄎ稽c(diǎn)進(jìn)行突變，再分別構(gòu)建到luciferase報(bào)告載體中，檢測(cè)其啟動(dòng)子活性。
信號(hào)通路研究：信號(hào)通路的激活/監(jiān)測(cè)基因的表達(dá)水平。
03 操作流程
質(zhì)粒構(gòu)建：雙螢光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)一般將螢火蟲螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒和海腎螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，或?qū)⑦@兩個(gè)報(bào)告基因構(gòu)建到同一個(gè)骨架質(zhì)粒上（如pGL4質(zhì)粒），分別用不同的啟動(dòng)子啟動(dòng)其表達(dá)。
細(xì)胞轉(zhuǎn)染：轉(zhuǎn)染方法選擇根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇瞬時(shí)轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染。對(duì)于短期表達(dá)的目的基因產(chǎn)物，可以選用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法，操作更為簡便。對(duì)于需要長期穩(wěn)定表達(dá)目的基因產(chǎn)物，建議選用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染法，穩(wěn)定性更好。主報(bào)告基因：內(nèi)參報(bào)告基因轉(zhuǎn)染比例通常為10:1-100:1，啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子比例啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子比例一般為1:9。
04 報(bào)告基因檢測(cè)
檢測(cè)儀器：發(fā)光檢測(cè)儀（Luminometer），或帶有發(fā)光檢測(cè)模塊的多功能酶標(biāo)儀。
發(fā)光模式：化學(xué)發(fā)光（Luminescence）。
檢測(cè)類別：終點(diǎn)法檢測(cè)。
波長范圍：無需設(shè)置波長，如需選擇，推薦全波長380-780 nm。注：只選擇在最大波長處檢測(cè)發(fā)光，過濾掉其他發(fā)光信號(hào)，意味著檢測(cè)會(huì)丟掉部分信號(hào)，損失靈敏度。
讀取模式：底讀或頂讀。
數(shù)據(jù)分析：通過酶標(biāo)儀等儀器讀出螢火蟲和海腎螢光素酶的數(shù)值，兩種熒光值讀數(shù)不少于4位數(shù)，讀數(shù)大于8位數(shù)時(shí)，需要稀釋裂解上清（讀數(shù)與細(xì)胞種類、細(xì)胞狀態(tài)、轉(zhuǎn)染方法、轉(zhuǎn)染時(shí)間等因素相關(guān)）。
相對(duì)表達(dá)倍數(shù)具體計(jì)算公式：歸一化值=螢火蟲螢光素酶讀值（主報(bào)告基因）/海腎螢光素酶讀值（內(nèi)參基因）相對(duì)表達(dá)倍數(shù)=實(shí)驗(yàn)組歸一化值/對(duì)照組歸一化值
怎么樣，看到這里大家有沒有掌握雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)的思路和方法呢？如果你還有其他問題，歡迎在評(píng)論區(qū)留言，和大家一起探討！
產(chǎn)品推薦
| 中文名稱 | 英文名稱 | 產(chǎn)品貨號(hào) |
| 雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 | Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit | N220011 |
| 單螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒 | Single Luciferase Reporter Gene Assay Kit | N220010 |
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