近日，伊利集團(tuán)與環(huán)特生物在國際期刊《Plos One》上聯(lián)合發(fā)表題為 《Bifidobacterium lactis BL-99 modulatesintestinal inflammation and functions inzebrafish models 》的文章（February 16, 2022）。
在過去幾十年里，糖的消耗量急劇增加。多項(xiàng)研究表明，糖的過度消耗與腸道通透性的改變和代謝疾病的發(fā)生密切相關(guān)。
乳雙歧桿菌BL-99是伊利集團(tuán)的專有菌株，已被商業(yè)化用于酸奶、冰淇凌、零食等產(chǎn)品。本研究旨在探討伊利這種獲得**的、具有耐胃酸和耐腸液性能的益生菌乳雙歧桿菌(bifidobacteriumlactis)BL-99，在斑馬魚模型中對腸道炎癥和功能的治療作用和機(jī)制。
該研究基于斑馬魚實(shí)驗(yàn)表明，BL-99或可緩解由不規(guī)律高糖引發(fā)的腸道炎癥，并改善腸道功能，為BL-99的功效潛力提供了新證據(jù)。
● 乳雙歧桿菌BL-99
雙歧桿菌是由法國學(xué)者初次分離出的一種厭氧革蘭氏陽性桿菌，末端常常分叉，因此稱為雙歧桿菌。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并測序幾十種雙歧桿菌，包括動(dòng)物雙歧桿菌 (B.animals)、長雙歧桿菌(B.longum)和短雙歧桿菌(B.breve)等。
雙歧桿菌在人體腸道內(nèi)是時(shí)刻變化的，嬰幼兒時(shí)期，腸道內(nèi)雙歧桿菌較多，但隨著年齡的增加，雙歧桿菌逐漸減少。在整個(gè)生命歷程中，腸道內(nèi)的雙歧桿菌維持著動(dòng)態(tài)平衡，這對于腸道正常功能的發(fā)揮及人體健康是至關(guān)重要的。
乳雙歧桿菌BL-99,是一株由內(nèi)蒙古伊利有限責(zé)任公司自主研發(fā)的益生菌。分離自中國健康嬰幼兒腸道，在中國科學(xué)院微生物所菌種保藏中心CGMCC進(jìn)行**寄存，保藏號為CGMCC156502-4。
乳雙歧桿菌BL-99無抗生素耐受，無抗生素轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)；毒理學(xué)評價(jià)表明BL-99無急毒、亞急毒特性，無體內(nèi)轉(zhuǎn)移風(fēng)險(xiǎn)，屬于具有較高安全等級的益生菌菌株。乳雙歧桿菌BL-99，已作為功能性食品成分用于伊利集團(tuán)的各類產(chǎn)品，例如酸奶、營養(yǎng)補(bǔ)劑、冰淇淋等。
乳雙歧桿菌BL-99，在改善腸道炎癥、促進(jìn)消化、調(diào)節(jié)免疫力、骨骼健康等方向得到了較好的科學(xué)驗(yàn)證。BL-99具有較好的耐酸能力、耐膽鹽特性，可在腸道內(nèi)保持活菌特性。
● 斑馬魚研究結(jié)果
斑馬魚（Danio rerio）的腸道成分與人類相似，如結(jié)締組織、外縱肌和環(huán)形肌等。隨著動(dòng)物福利“3R原則（Reduction, Replacement, Refinement）”的實(shí)施，斑馬魚已被用作篩選腸道益生菌的替代模式生物。
研究發(fā)現(xiàn)，乳雙歧桿菌BL-99能夠在斑馬魚腸道中留存超過24h，促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，有效緩解硫酸鋁引起的便秘癥狀 ( p< 0.01)；
不規(guī)律高糖飲食，易誘發(fā)斑馬魚腸道功能和代謝紊亂；
為腸道功能和代謝紊亂的斑馬魚喂食乳雙歧桿菌BL-99后，其IL-1β的基因表達(dá)顯著下調(diào)，IL-10、IL-12基因水平顯著上調(diào)（p < 0.05），腸道脂肪酶活性提高，但類胰蛋白酶未發(fā)生明顯變化( p > 0.05)；
組織病理學(xué)與代謝組的分析表明，BL-99改善了斑馬魚腸道炎癥，杯狀細(xì)胞數(shù)量增加，其代謝物水平恢復(fù)；
BL-99或可通過調(diào)節(jié)斑馬魚的腸道和微生物代謝，來緩解腸道炎癥和改善腸道功能。
● 實(shí)驗(yàn)結(jié)論
1. 斑馬魚幼魚的研究
如圖1A 和 1B 所示，在喂食BL-99后的2h、6h和24h，斑馬魚幼魚腸道熒光強(qiáng)度分別為6.02±0.866、10.7±1.08和13.0±0.601像素。比較24小時(shí)和2小時(shí)的熒光強(qiáng)度，p < 0.001，但比較24小時(shí)和6小時(shí)的熒光強(qiáng)度時(shí)，p >0.05，表明乳雙歧桿菌BL-99在喂食6小時(shí)后有效地保留在斑馬魚的腸道中。
圖1. 斑馬魚腸道中的乳雙歧桿菌BL-99保留和持續(xù)時(shí)間段
對腸蠕動(dòng)和便秘的治療作用
如圖2B和2C所示，正常斑馬魚腸道的熒光強(qiáng)度為403493±37456像素，硫酸鋁處理斑馬魚腸道熒光強(qiáng)度為517757±11985像素（p < 0.01），說明斑馬魚便秘模型成功建立。
陽性對照藥物多潘立酮能顯著促進(jìn)腸道蠕動(dòng)，在用BL-99處理的斑馬魚潤腸通便模型中，發(fā)現(xiàn)劑量依賴性，腸道熒光強(qiáng)度降低。
圖 2 BL-99對斑馬魚腸道蠕動(dòng)和便秘的作用效果。腸道熒光BL-99示意圖，乳雙歧桿菌BL-99 和斑馬魚的分析區(qū)域 (A)。斑馬魚腸道中的尼羅紅熒光強(qiáng)度 (B) 和定量分析 (C)。
2. 成年斑馬魚的研究
2.1 炎癥與免疫基因表達(dá)
提取的RNA (A260/A280) 的純度在1.95-2.12范圍內(nèi)，如圖3A所示，經(jīng)3%的葡萄糖處理的斑馬魚顯示出IL-1β基因表達(dá)的上升。經(jīng)BL-99處理的斑馬魚模型中，觀察到IL-1β基因表達(dá)的濃度依賴性下降，BL-99組較對比組下降。
圖3.不規(guī)律高糖飲食誘導(dǎo)的成年斑馬魚腸道功能紊亂、腸道組織炎癥、免疫基因表達(dá)及消化酶定量。斑馬魚腸道中的IL -1β基因水平 (A)、 IL-10基因水平 (B) 和IL-12基因水平 (C)。成年斑馬魚腸道中的脂肪酶活性 (D) 和胰蛋白酶含量 (E)。
如圖3B所示，經(jīng)3%的葡萄糖處理的斑馬魚顯示出IL-10基因表達(dá)的下降。相對于模型組（圖3C），BL-99在2.42*106、2.42*107和2.42*108 CFU/mL的濃度下，IL-10和IL-12的表達(dá)水平分別升高到3.96±0.219、1.27±0.150和1.85±0.176倍(p<0.001,p>0.05,p>0.05)和 1.01±0.097, 1.51±0.368和4.13±0.745倍(p>0.05,p<0.01,p<0.001)。
2.2 脂肪酶活性和胰蛋白酶含量
如圖3D所示，經(jīng)3%的葡萄糖處理的斑馬魚顯示，腸脂肪酶活性降低。在用2.42*106、2.42*107和 2.42*108 CFU/mL的BL-99處理的斑馬魚模型中，可以觀察到脂肪酶活性的濃度依賴性增加。BL-99處理的脂肪酶活性與對比組相比分別為16.4±1.10、18.2±1.15和31.8±2.58 U/g蛋白（p<0.05，p<0.01，p<0.001）。
盡管BL-99 顯示出增加的趨勢，但它對腸道胰蛋白酶含量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的影響，如圖3E所示。
2.3 腸組織病理學(xué)
如圖4A所示，H&E染色表明，正常斑馬魚的腸道具有較厚的腸壁、發(fā)達(dá)的肌肉層（a1，藍(lán)色雙頭箭頭）和腸絨毛。腸絨毛高度高、面積大、交錯(cuò)分枝或指狀。正常腸杯狀細(xì)胞（b，黑色單向箭頭）數(shù)量眾多，頭部大而圓，在腸絨毛上皮細(xì)胞之間排列成行；淋巴細(xì)胞（c，黃色單向箭頭）分布在細(xì)胞內(nèi)的單層柱狀上皮中（圖4B）。模型組斑馬魚腸壁變薄（a2），絨毛稀疏且高度明顯降低，腸腔擴(kuò)張（d，黑色雙箭頭）；杯狀細(xì)胞數(shù)量顯著減少；淋巴細(xì)胞數(shù)量減少（圖4C）。
與模型組相比，BL-99處理導(dǎo)致高絨毛發(fā)育，杯狀細(xì)胞和柱狀上皮細(xì)胞增多，腸道組織形態(tài)與正常斑馬魚非常相似（圖4D）。
圖4.用BL-99處理的斑馬魚腸道中，不規(guī)則高糖飲食引起的腸道功能障礙的組織病理學(xué)
3. 代謝特征
如圖5所示，在正負(fù)離子模式下，正常對照組和模型組有明顯的分離。正常斑馬魚與斑馬魚模型組相比，腸道內(nèi)有106種正離子代謝物和218種負(fù)離子代謝物發(fā)生顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)變化；213種正離子代謝物和402種負(fù)離子代謝物在模型斑馬魚和用BL-99處理的模型斑馬魚之間存在著顯著的差異。
圖5.腸道代謝譜的偏小二乘判別分析 (PLS-DA)。(A) 腸道功能障礙的斑馬魚模型組和正常組 (未治療) 之間處于正離子模式和 (B) 處于負(fù)離子模式; (C) 腸道功能障礙斑馬魚模型組和用BL-99處理的斑馬魚模型之間處于正離子模式和 (D) 處于負(fù)離子模式。
圖6A顯示了腸道功能障礙斑馬魚（模型）和正常（未處理）斑馬魚之間代謝物顯著變化的熱圖，以及是否用BL-99處理的斑馬魚的熱圖。
圖 6.顯著變化的代謝物熱圖
● 討論
在過去幾十年里，糖的消耗量急劇增加，糖的過度消耗與腸道通透性和代謝疾病密切相關(guān)。
在本研究中，給斑馬魚喂食不規(guī)則的3%葡萄糖2周，腸道炎癥因子IL-1β基因表達(dá)升高，腸道免疫因子降低，從而誘發(fā)腸道炎癥和功能障礙。IL-10和IL-12基因水平降低、腸道脂肪酶活性降低、腸道組織學(xué)受損和腸道代謝組學(xué)紊亂。在乳雙歧桿菌BL-99處理后，斑馬魚腸道炎癥得到緩解，腸道免疫反應(yīng)增強(qiáng)，腸道黏液屏障和組織病理學(xué)得到改善。
值得一提的是，在3%葡萄糖誘導(dǎo)的斑馬魚腸道功能障礙模型中觀察到腸道代謝障礙，包括腸道細(xì)胞和腸道微生物群代謝。例如，發(fā)現(xiàn)了6種腸道細(xì)胞功能相關(guān)代謝物（瓜氨酸、甘油、CDP-乙醇胺、葡萄糖酸內(nèi)酯、尿苷和尿嘧啶）和5種腸道微生物群相關(guān)代謝物（牛磺酸、中康酸、脲基琥珀酸、乳清酸和 4-羥基苯甲醛）。這11種代謝物，加上2種有機(jī)化合物雙-γ-谷氨酰胱氨酸和 R-硫辛酸，在經(jīng)3%葡萄糖喂食過的斑馬魚腸道中均顯著增加。
令人驚訝的是，經(jīng)乳雙歧桿菌BL-99處理，這些腸道和微生物群代謝物恢復(fù)到與正常對照斑馬魚相似或接近的水平。
這些結(jié)果表明，乳雙歧桿菌BL-99或可緩解由不規(guī)律高糖引發(fā)的腸道炎癥，并改善腸道功能（圖7）。但是，未來仍需進(jìn)一步開展人體試驗(yàn)，以進(jìn)一步確認(rèn)該菌株在人體中的功效。
圖7. BL-99 調(diào)節(jié)腸道炎癥與功能的可能機(jī)制