編者按
目前對眼表的研究主要集中在角膜方面，但結膜對視力同樣至關重要。結膜上皮包含產生黏液的杯狀細胞和分泌水的角化細胞，其作用使得眼頂端表面呈現黏液，為眼表提供免疫保護。當結膜功能發生障礙，也會影響角膜的內穩態，繼而引起失明。
現今結膜的功能研究主要借助于短期培養的外植體或誘導的多能干細胞，但均存在一定的局限性。前者培養條件不明確，培養效率低；后者難以再現結膜上皮的細胞多樣性和成熟度，導致相關探索缺乏有效的體外模型。已知成體干細胞形成的類器官可以在明確的培養體系下生長，并應用于多種人類生理和疾病的探究。
今天我們來解讀2024年1月由荷蘭Hubrecht研究所在《Cell Stem Cell》上發表的一項最新研究成果，該研究利用原代結膜組織建立了小鼠和人源結膜類器官長期培養的方法，這些類器官能夠表現結膜上皮的關鍵特征。單細胞測序結果顯示角質形成細胞表達多種抗菌肽，并識別結膜簇細胞。利用1型單純皰疹病毒 (HSV1)、8型人類腺病毒 (hAdV8)和SARS-CoV-2對結膜類器官感染，模擬病毒性結膜炎，發現阿昔洛韋可以逆轉HSV1感染，而缺乏批準藥物治療的hAdV8感染可以被西多福韋抑制。同時，該研究證明了結膜類器官的移植潛力。綜上，結膜類器官為結膜的生理病理研究提供了一個強有力的工具。
文章題目
Human conjunctiva organoids to study ocular surface homeostasis and disease
雜志：Cell Stem Cell（IF=23.9）
發表時間：2024.1.11
作者：Marie Bannier-Hélaouet，Jeroen Korving等
單位：荷蘭Hubrecht研究所等
01、研究結果
1. 基于胰酶體系對C57小鼠及人源眼結膜組織進行消化處理，獲取原代細胞，種膠培養后均可觀察到略顯實質的球體類器官（圖1）。
持續培養，在該體系下結膜類器官均能夠穩定傳代擴增。免疫組化結果顯示，形成的類器官陽性表達與結膜組織相似的上皮標志物KRT19、基底細胞標志物TP63+、角化細胞標志物粘蛋白MUC1及調控眼睛發育相關的標志物PAX6，但杯狀細胞標志物MUC5AC+幾乎不含有。
圖1
2. 杯狀細胞是結膜組織中的一類重要功能細胞，為了使類器官中形成更多的杯狀細胞，研究人員首先調整培養體系，去除Wnt等生長相關因子。在分化培養體系作用下，類器官KRT19和MUC1的表達始終存在，MUC5AC+細胞數量增加的同時TP63+基底細胞數量減少。
接著，研究者們借助“氣-液”培養體系對類器官進一步處理，發現該體系下在不影響陽性表達MUC1和TP63+細胞數量的前提下，還能進一步提高MUC5AC+細胞比率，且培養體系引入IL-4/IL-13能有效提升杯狀細胞的分化情況（圖2）。
圖2
3. 利用單細胞mRNA測序將構建的類器官與原始組織進行比對（圖3），類器官中包含組織中同樣擁有的基質相關細胞（黑素細胞、T細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、內皮細胞和成纖維細胞）以及四種上皮細胞（基底細胞、角質細胞、杯狀細胞和簇狀細胞）。
利用液相色譜-串聯質譜(LC-MS/MS)對氣液培養后的上清進行分析，可檢測到上百種蛋白質的存在。在培養體系中加入IL-4/IL-13后，參與止血（THBS1和IL-19）、ECM重塑（POSTN）、肽酶活性（LYZ）、先天免疫反應激活（PIGR、CFD和CFB）和糖基化（MUC5AC、MUC1和MUC4）相關的蛋白上調，提示結膜上皮在體外對炎癥信號有應答反應。
圖3
4. 由于缺乏長期體外模型，病毒性結膜炎一直難以在實驗室進行研究。研究人員使用1型單純皰疹病毒 (HSV1)、8型人類腺病毒 (hAdV8)和SARS-CoV-2與“氣-液”培養后的類器官孵育，可觀察到病毒的侵染，并發現阿昔洛韋可以逆轉HSV1感染，而缺乏批準藥物治療的hAdV8感染可以被西多福韋抑制。
圖4
5. 為了探究類器官修復受損結膜的應用潛力，研究人員將早期培養的類器官移植至預先經過機械損傷的免疫缺陷NSG小鼠結膜中。
結果顯示，在這些移植小鼠中，細胞附著在基底膜上并產生3種主要的結膜細胞類型:TP63+基底細胞、MUC1+角質形成細胞和MUC5AC+杯狀細胞，且人源類器官形成的上皮比小鼠的上皮更厚，再現了人結膜的特征。
圖5
02、編者點評
綜上，本研究利用原代結膜組織建立了小鼠和人源結膜類器官長期培養的方法，這些類器官能夠表現結膜上皮的關鍵特征；單細胞測序結果顯示角質形成細胞表達多種抗菌肽，并識別結膜簇細胞；利用1型單純皰疹病毒 (HSV1)、8型人類腺病毒 (hAdV8)和SARS-CoV-2對結膜類器官感染，模擬病毒性結膜炎，發現阿昔洛韋可以逆轉HSV1感染，而缺乏批準藥物治療的hAdV8感染可以被西多福韋抑制。同時，該研究證明了結膜類器官的移植潛力。
本研究建立的結膜類器官，為結膜的生理病理研究提供了一個強有力的工具，并探討了這一研究對開發個性化醫學和藥物篩選平臺的潛力，為研究結膜疾病打開了大門，具有重要的科學意義和臨床應用前景。
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