RNA質量對PCR（尤其是RT-qPCR）實驗結果的準確性和可靠性具有至關重要的影響，在進行RT-qPCR或RNA測序等實驗之前，必須對RNA的完整性、純度和濃度進行全面評估。

RNA濃度評估

核酸分子所含的嘌呤和嘧啶堿基具有共軛雙鍵，在260nm波長處有最大吸收峰，因此，核酸的最大吸收波長為260nm，但它無法區分出DNA、RNA、降解核酸、游離核苷酸等雜質；蛋白質分子中常含有酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等苯環結構，通常在280nm處有最大吸收峰；而碳水化合物，多肽，苯酚、EDTA等污染物的最大吸收峰則在230nm處，如圖1。

圖1. 核酸、蛋白質、污染物的最大吸收峰（圖源網絡）

對于RNA的濃度來說，根據朗伯-比爾定律可計算出在波長260nm的紫外線下，1個OD值的光密度大約相當于40µg/ml的RNA^[1]，即RNA的濃度（µg/µl）= OD260×40×稀釋倍數/1000。比如OD260為0.16，2µl樣本稀釋至200µl，即稀釋倍數為100，RNA的濃度（µg/µl）= 0.16×40×100/1000µg/µl=0.64µg/µl。

RNA純度評估

一般來說，OD260/280=1.8-2.1，證明純度較好，值得一提的是，OD260/280的比值會受到pH的影響，當用中性的水溶解RNA時候，RNA呈酸性，比值可能只有1.8-2.0之間；當用TE溶解RNA時，比值會稍偏高，可能在1.9-2.1之間。

1）OD260/280<1.8，可能有蛋白質或基因組的殘留；

2）OD260/OD280 > 2.1，表明RNA有部分降解，如果直接將其反轉得到的cDNA用于qPCR實驗，可能會導致ct值偏大甚至沒有ct值；

3）OD260/OD230 < 2.0，可能有鹽離子、有機溶劑、碳水化合物等的污染，比如用trizol提取法中殘留的的異硫氰酸胍會導致230nm處的吸光值升高，從而導致比值偏低。

純度也可以通過瓊脂糖瓊膠電泳進行評估，如下圖：

圖2. RNA中有DNA（左）或蛋白質（右）的殘留

由圖2可看出，若泳道上部有明顯的高分子量雜帶，則可能是有DNA的殘留，不建議用于后續的qPCR實驗，會對實驗的準確性造成影響（圖2左）；若在膠孔處有比較亮的著色成分，則是有蛋白質的殘留（圖2右）。

RNA完整性評估

除了濃度、純度外，RNA完整性也是判斷RNA質量的重要指標。RNA完整性一般可通過瓊脂糖凝膠電泳來進行評估?？俁NA中占比達80%以上的是核糖體RNA（rRNA），因此，膠圖呈現的結果主要是rRNA。

圖3. 高質量RNA（左）和已降解RNA（右）的瓊脂糖凝膠電泳膠圖

對于真核生物來說，高質量的RNA通常有三條帶，最亮的是28S，其次是18S，最淡的是5S。28S條帶亮度應為18S條帶亮度的2倍(圖3左)，若RNA呈現彌散狀，表明RNA已降解（圖3右）。

附：RNA電泳注意事項：

1）電泳槽和膠板經0.5 M NaOH浸泡0.5 h去除RNase；

2）緩沖液和瓊脂糖凝膠都需新配制，采用RNase-free H₂O配制電泳緩沖液；

3）關于marker的選擇，建議使用RNA marker；

4）RNA電泳宜使用高電壓短時間的方法，以防電泳過程中RNA的降解。

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