編者按
當前，腦血管疾病是威脅人類健康與生存的重大疾病之一，其中又以腦缺血較為多見，目前臨床上主要的治療方式是盡早恢復缺血區血液再灌注，使腦組織重新獲得血氧供應，但常伴隨腦缺血再灌注損傷（cerebral ischemia reperfusion injury，CIRI）。
天麻（Gastrodia elata，GE）具有緩解中風、抑制肝陽、祛風通絡的作用，目前已在臨床實踐中得到了廣泛應用。我們之前的實驗研究已證實，天麻對腦缺血再灌注損傷具有一定的治療作用，但天麻治療CIRI的有效成分尚不清楚，則需要進一步研究。
今天，我們特別回顧一項2024年11月10日發表在 《Phytomedicine》上的研究成果，該研究基于“光譜效應”分析并利用斑馬魚缺血性腦卒中模型，驗證了天麻（GE）改善腦缺血再灌注損傷（CIRI）的潛在有效成分，彌補了化學成分和藥效學分開研究的缺點，為天麻的臨床應用提供了理論支撐，也為進一步開展中藥質量評價提供了理論依據，為中藥復方復雜成分的作用機制探究提供了"化學分析-活體藥效-機制闡釋"的研究范式。
文章題目
Exploration the effective components of Gastrodia elata in improving cerebral ischemia reperfusion injury based on “Spectrum-effect” correlation and zebrafish verification experiment
雜志：Phytomedicine（IF=7.9，中科院JCR雙1區Top期刊）
發表時間：2024年11月10日
作者：桂雙英教授、汪小莉教授等
單位：安徽中醫藥大學等圖片
圖1 圖形摘要
01、研究亮點
1. 首次采用"譜效關系"與斑馬魚模型結合：
研究中，通過超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（UHPLC-Q-TOF/MS）（"譜"）與藥效學指標（"效"）的關聯分析，鑒定了GE在大鼠血清中的吸收成分和代謝產物，篩選出天麻中改善腦缺血再灌注損傷的潛在有效成分，并利用斑馬魚腦卒中模型，直觀驗證了GE活性成分的體內作用，實現了從化學表征到生物學驗證的全鏈條研究。
2. 多維度靶向篩選，突破傳統中藥活性成分篩選模式：
本研究通過譜效相關性計算（如灰色關聯度、偏最小二乘法等）篩選出天麻中與抗腦缺血再灌注損傷密切相關的化合物群（如天麻素、對羥基苯甲醇等），突破了單一成分研究的局限，揭示了多成分協同作用機制。
3. 利用斑馬魚模型直觀驗證活性成分的作用：
利用斑馬魚腦卒中模型，評價不同處理組斑馬魚的腦血栓面積大小、腦細胞凋亡程度、腦組織生化指標及血液流變學變化等，快速驗證天麻提取物及關鍵成分——對羥基苯甲醛（PHB）、對羥基苯甲醇（PHBA）、天麻素（GA）治療腦缺血再灌注損傷的效果。斑馬魚實驗表明，PHB、PHBA和GA可通過調節氧化應激與凋亡來有效改善腦血栓形成。
4. 明確天麻中的關鍵活性成分：
研究發現，天麻中的天麻素（GA）和對羥基苯甲醇（PHBA）是天麻抗腦缺血再灌注損傷的核心成分，通過抑制氧化應激、調控Nrf2/HO-1通路顯著減輕腦缺血損傷，為后續開發標準化中藥制劑或創新藥物提供了科學依據。
02、研究概述
缺血性腦卒中屬于中醫理論中的“中風”范疇?；謴脱汗侵委熑毖阅X卒中的最有效方法，但在治療過程中可能會發生腦缺血再灌注損傷（CIRI）。中風是全球第三大死亡原因，而腦缺血具有高發病率、高致殘率、高致死率和高復發率等特點，CIRI是腦缺血的重要病理生理環節，其病理生理機制非常復雜。中醫強調治療疾病的“整體觀念”，通過多靶點、多途徑來治療腦缺血，對CIRI有較好的保護作用，且毒副作用較小，因此，亟需為CIRI患者尋找潛在有效的傳統中藥治療策略。
天麻（GE）最早記載于《神農本草經》中，具有熄風止痙、平肝陽等功效。缺血性中風作為一種“風”病，CIRI常會導致不可逆的腦損傷及神經元損傷，甚至死亡，這涉及許多復雜的病理過程，如氧化應激、炎癥、細胞凋亡等。已有研究表明，天麻（GE）通過減少炎癥、抗氧化損傷、抑制細胞凋亡等對缺血性腦損傷（CIRI）具有保護作用，因此，探究天麻（GE）在治療CIRI中的有效活性成分具有重要的臨床意義。然而，目前對天麻（GE）具體作用成分的系統性研究還較少，需要建立一種快速有效的分析方法來闡明其化學成分及其藥理基礎。
中藥的提取、分離方法長期存在耗時、效率低下等問題，UHPLC-Q-TOF/MS以檢測范圍廣、檢測速度快、檢測結果準確等優點，被廣泛用于對中藥化合物進行全面表征。因此，本研究采用UHPLC-Q-TOF/MS技術對GE的化學成分進行了分析，為其藥理學基礎研究及質量標準制定提供了參考。
現代研究表明，GE中含有酚類及其糖苷、多糖和甾醇等成分。這些成分中，酚類化合物及其糖苷已被證明與GE的藥理活性密切相關。盡管已有不少對GE化學成分及藥理作用的研究，但GE改善CIRI的活性成分尚不清楚。因此，找到一種有效的方法來闡明GE的主要藥效物質基礎非常重要。
本研究中，利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間串聯質譜（UHPLC-Q-TOF/MS）對GE外源性化學成分及血漿藥物含量進行定性分析，鑒定天麻在大鼠血清中的吸收成分及代謝產物。天麻（GE）中共檢出45種化學成分，并在大鼠血清中鑒定出87種活性成分（包括25種原型成分和62種代謝產物）。
通過光譜與效應相關性分析，將化學成分的動態變化與藥效學指標的動態變化聯系起來，并采用藥效指標與成分響應的灰色關聯統計方法篩選潛在活性成分，并結果表明，天麻（GE）通過調節白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）水平改善CIRI?；疑P聯統計顯示，天麻中的對羥基苯甲醛（PHB）、對羥基苯甲醇（PHBA）及天麻素（GA）可能是其核心活性成分。
斑馬魚體積小、通體透明，且能夠直觀可視化觀察其心血管系統，因此是研究血腦屏障和神經血管發育的有力工具。而且，斑馬魚血小板在結構和功能上與哺乳動物血小板具有同源性，與人類也有類似的止血過程，也是研究血栓性疾病的良好模型。因此，越來越多的研究人員通過基因編輯、藥物誘導或化學誘導構建斑馬魚缺血性卒中模型，來開展藥物篩選及研究。
帕納替尼(Ponatinib)是一種多靶點酪氨酸激酶抑制劑，已被證明具有血管毒性并可能誘導血栓形成。將其用于2dpf（受精后第二天）斑馬魚，構建斑馬魚缺血性卒中模型，該模型具有血管系統發育早、血管透明且易于成像等優勢。其血栓形成、內皮損傷等病理特征也與人類缺血性卒中高度相似，能實時監測血流動態、腦血栓形成、神經損傷及修復過程，有助于探究缺血性腦損傷（CIRI）潛在機制，并尋找新的治療靶點。
本研究中，通過在斑馬魚缺血性卒中模型中對篩選出的潛在有效成分進行藥效學驗證，表明對羥基苯甲醛（PHB）、對羥基苯甲醇（PHBA）、天麻素（GA）可通過調節氧化應激與細胞凋亡來有效改善腦血栓形成，從而治療腦缺血再灌注損傷。
圖2 研究機制
03、斑馬魚研究結果
本研究利用斑馬魚缺血性卒中模型，通過不同處理組斑馬魚的腦血栓面積大小、腦細胞凋亡程度、腦組織生化指標和血液流變學變化等指標進行評估，直觀驗證了篩選出的天麻活性成分的體內作用。
1. 腦血栓面積大小、腦細胞凋亡程度評估
與對照組相比，Ponatinib（PON）組的腦血栓區域顯著增加；而與PON組相比，陽性對照組（DBT）、Gastrodin組（GA）、P-hydroxybenzyl alcohol組（PHBA）和P-hydroxybenzaldehyde組（PHB）的腦血栓區域分別顯著減少了87.8%、46.8%、88.6%和84.8%。這些結果表明，GA、PHBA和PHB可以抑制PON誘導的腦血栓形成。不同組別斑馬魚腦血栓的結果見圖 3 (A-B)。
為了檢測細胞凋亡，在PON組的斑馬魚大腦中發現，熒光顆粒的數量顯著增加，表明存在大量的腦細胞凋亡；而在DBT、GA、PHBA和PHB的處理下，斑馬魚大腦中的凋亡細胞數量顯著減少，表明GA、PHBA和PHB能夠有效減輕PON誘導的腦卒中所致的腦細胞凋亡。不同組別斑馬魚大腦凋亡的結果見圖 3 (C-D)。
圖3 腦血栓區域和細胞凋亡圖
2. 腦指標生化指標檢測
與正常組相比，模型組斑馬魚腦組織中的ROS、NO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著升高（P<0.01），而SOD水平顯著降低（P<0.01）。與模型組相比，DBP組（陽性對照組）、GA組、PHBA組和PHB組斑馬魚腦組織中的ROS、NO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著降低（P<0.01），而SOD水平顯著升高（P<0.01），如圖 4（A-G）所示。
由于PON在斑馬魚中誘導血栓形成，導致血流阻塞。與對照組相比，PON組斑馬魚的動脈和靜脈血流速度顯著降低。在接受DBP、GA、PHBA和PHB治療后，斑馬魚的動脈和靜脈血流速度出現顯著反彈，表明GA、PHBA和PHB有助于促進血流恢復，同時消除血栓。動脈血流速率和靜脈血流速率的結果見圖 4 (H-I)。
圖4 斑馬魚藥效學和血液流變學結果 (A-G) 不同藥物對各組斑馬魚CIRI模型中ROS、NO、MDA、TNF-α、IL-6和IL-1β水平的影響；(H-I) 各組斑馬魚動靜脈血流速度的檢測結果。
04、編者點評
本研究通過UHPLC-Q-TOF/MS技術對天麻的外源性化學成分和含藥血漿進行了定性識別分析，并通過譜效相關性分析將化學成分的動態變化與藥效學指標的動態變化聯系起來，以探究天麻改善CIRI的藥效物質基礎，證實天麻中的對羥基苯甲醇、天麻素及對羥基苯甲醛是其抗CIRI的核心活性成分群，其作用機制涉及Nrf2/HO-1通路激活與凋亡抑制。通過斑馬魚模型實驗評估了GA、PHB和PHBA的作用，發現這些成分對改善腦缺血損傷具有一定的效果。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！