實時定量PCR（qPCR）是基因表達(dá)研究中不可或缺的技術(shù)手段，通常包括反轉(zhuǎn)錄（RT）和定量PCR（qPCR）兩個核心步驟。根據(jù)操作流程的不同，qPCR可分為一步法和兩步法兩種策略。那么在實際操作中，我們該如何在這兩種方法中進(jìn)行選擇呢？
01 一步法：高效簡潔，適合高通量單基因分析
一步法將反轉(zhuǎn)錄與qPCR置于同一反應(yīng)管中進(jìn)行，直接以RNA為模板啟動反應(yīng)。
圖 一步法qPCR示意圖
優(yōu)點：
高效便捷：操作簡便，加樣次數(shù)少，有效降低污染風(fēng)險。
操作簡單：方法設(shè)置快速，擴(kuò)增少數(shù)靶標(biāo)基因時，可以輕松處理多個樣品；尤其適用于多樣本中同一基因的表達(dá)檢測。
高靈敏度：一步法直接對cDNA進(jìn)行擴(kuò)增，靈敏度更高，能夠檢測到極微量的RNA，使研究者能夠捕捉到微小的基因表達(dá)變化。
局限：
模板要求高：對RNA模板質(zhì)量要求較高，模板質(zhì)量優(yōu)劣嚴(yán)重影響逆轉(zhuǎn)錄效率。
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量較低：一步法反轉(zhuǎn)錄使用基因特異性引物，而兩步法使用Oligo dT和Random Primer作為引物，一步法反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物低于兩步法。
引物異常：上下游基因特異性引物易形成引物二聚體，干擾后續(xù)熒光定量。
酶活抑制：DNA聚合酶酶活受到逆轉(zhuǎn)錄體系中某些組分的抑制，影響擴(kuò)增效率。
盡管通過酶改造與體系優(yōu)化，目前的一步法試劑已在兼顧兩種酶活性方面取得顯著進(jìn)展，但仍需謹(jǐn)慎評估實驗條件。
02 兩步法：靈活通用，適合多基因檢測與珍貴樣本
兩步法先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行qPCR，實現(xiàn)對RNA的間接定量。
圖 兩步法qPCR示意圖
優(yōu)點：
反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量高：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量高于一步法，對RNA起始量適應(yīng)范圍寬。
產(chǎn)物應(yīng)用廣泛：中間產(chǎn)物 cDNA 能夠建立可以長期保存，用于克隆、建庫等其它用途。
多基因檢測：可實現(xiàn)高通量多基因檢測。
便于條件優(yōu)化：每一步可獨立優(yōu)化反應(yīng)條件，靈活性更高，可以在困難的PCR情況和靶標(biāo)豐度可變時進(jìn)行調(diào)整。
酶活不受限：該方法將RT和qPCR兩種酶促反應(yīng)分開進(jìn)行，更便于RT Enzymes和DNA Polymerase酶活性的釋放。
局限：
繁瑣耗時：操作步驟較多，耗時較長。
誤差風(fēng)險：多次移液可能增加污染和操作誤差的風(fēng)險。
03 如何選擇？
如果你需要對大量樣本中的單個基因進(jìn)行快速檢測，推薦使用一步法，它適合使用經(jīng)過充分測試的引物進(jìn)行優(yōu)化反應(yīng)的高通量鑒定。
如果你需要對同一樣本中的多個基因進(jìn)行表達(dá)分析，或RNA樣本量比較珍貴、質(zhì)量不高，靶標(biāo)沒有得到充分驗證可能需要返回測試新靶標(biāo)，又或者后續(xù)還需利用cDNA進(jìn)行其他實驗，則兩步法是更合適的選擇。
理解兩種方法的原理與適用場景，結(jié)合實際實驗需求與樣本條件，才能做出最明智的決策，保障科研結(jié)果的準(zhǔn)確與可靠。
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