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腫瘤藥物開發(fā)的過(guò)程需要在生化和細(xì)胞水平上評(píng)估所使用的物質(zhì)的生物活性、藥理效應(yīng)和治療價(jià)值。整個(gè)篩選過(guò)程需要應(yīng)用于藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停渲袆?dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ褪浅Ｒ?jiàn)的藥理毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀Ｔ诿绹?guó)東部時(shí)間9月29日，美國(guó)參議院通過(guò)了FDA現(xiàn)代化法案2.0，該法案廢除了1938年食品、藥品和化妝品法案（FDCA）中所有藥物都必須在動(dòng)物上進(jìn)行毒性測(cè)試的規(guī)定。值得注意的是，該法律并沒(méi)有禁止動(dòng)物測(cè)試，而是允許藥物開發(fā)者在可行的情況下使用替代方法。其他方法，如類器官和人工智能（AI），也可能作為實(shí)驗(yàn)方法。

圖：不同模型系統(tǒng)特征的比較[1]

PDO 模型

患者衍生的類器官（PDOs）是通過(guò)體外培養(yǎng)來(lái)自患者的腫瘤組織獲得的實(shí)體，這些組織通過(guò)活檢、穿刺或外科手術(shù)切除并在體外培養(yǎng)一定時(shí)間。PDOs在保持原腫瘤的異質(zhì)性和患者間異質(zhì)性的同時(shí)，也展現(xiàn)出在個(gè)體間的均勻形態(tài)和規(guī)模，為藥物篩選提供了更為便捷的解決方案。在PDOs的制備過(guò)程中，基質(zhì)膠作為重要材料，能夠加速PDOs的形成。

基質(zhì)膠的主要成分包括層粘連蛋白、IV型膠原、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖（HSPG）、nidogen，以及TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織纖溶酶原激活物等生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子在EHS腫瘤中天然存在。它為組織和細(xì)胞提供了支持、拉伸強(qiáng)度和支架支持。由Arcegen Biology開發(fā)和生產(chǎn)的Arcegel™ Matrix Gel不含LDEV（乳酸脫氫酶增高病毒），內(nèi)毒素含量超低，并且經(jīng)過(guò)徹底的支原體檢測(cè)以確保無(wú)污染，包括不同類型如基礎(chǔ)濃度、高濃度、低生長(zhǎng)因子濃度等的基質(zhì)膠。
 

使用說(shuō)明

產(chǎn)品特點(diǎn)

高安全性：無(wú)LDEV（乳酸脫氫酶升高病毒）

多種濃度：濃度范圍在8至20毫克/毫升之間

良好的批間穩(wěn)定性：嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量檢驗(yàn)流程確保不同批次之間的性能穩(wěn)定

低內(nèi)毒素水平：內(nèi)毒素含量小于8 EU/毫升

污染物檢測(cè)：經(jīng)檢測(cè)無(wú)支原體、細(xì)菌和真菌殘留

高產(chǎn)量：產(chǎn)量超過(guò)30升/月

良好的兼容性：與任何類型的細(xì)胞培養(yǎng)基兼容
 

體內(nèi)腫瘤形成實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)步驟

以HepG2細(xì)胞在裸鼠中進(jìn)行皮下腫瘤形成實(shí)驗(yàn)為例，Arcegel高濃度基質(zhì)膠和細(xì)胞懸浮液按1:1比例稀釋后，皮下注射到4-5周齡的雌性BALB/c-nu裸鼠中。實(shí)驗(yàn)步驟如下：

1. 細(xì)胞收集前，準(zhǔn)備對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，細(xì)胞密度大約為80-90%，并于細(xì)胞收集前夜更換為新鮮培養(yǎng)基。

2. 用胰酶消化細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞變圓但未從培養(yǎng)皿上脫離時(shí)移去胰酶，加入無(wú)血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸浮液，離心并洗滌一次，重懸至最終濃度為5×10^7細(xì)胞/毫升。

3. 在4°C下將細(xì)胞懸浮液和Arcegel高濃度基質(zhì)膠按1:1比例稀釋，制備最終濃度為5×10^7細(xì)胞/毫升的混合物。

4. 用左手固定裸鼠，在鼠的右肩部皮下注射混合物。接種時(shí)，針頭要稍微深入皮下，約1厘米深，以減少注射后細(xì)胞懸浮液從針孔溢出。注射體積為200微升。（此過(guò)程應(yīng)在半小時(shí)內(nèi)完成，細(xì)胞懸浮液應(yīng)放置在冰上，以減緩細(xì)胞凋亡并防止凝膠化）。

5. 將裸鼠放回籠中繼續(xù)飼養(yǎng)。大約1周到1個(gè)月后可以觀察到腫瘤。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，當(dāng)腫瘤體積達(dá)到所需大小時(shí)，對(duì)裸鼠實(shí)施安樂(lè)死并拍照。

注意：對(duì)照組由培養(yǎng)基和細(xì)胞的懸浮液組成，最終密度與基質(zhì)膠實(shí)驗(yàn)組相同。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖：HepG2細(xì)胞在BALB/c-nu小鼠中1個(gè)月后的腫瘤形成情況

常見(jiàn)問(wèn)題解答

01. 為什么收到的基質(zhì)凝膠會(huì)出現(xiàn)顏色變化（從淡黃色變?yōu)樯罴t色）？
對(duì)于含有酚紅的基質(zhì)凝膠，顏色變化的主要原因是酚紅與碳酸氫鹽和二氧化碳之間的相互作用。然而，在與5%二氧化碳平衡后，顏色差異會(huì)減小。解凍后，輕輕搖晃試劑瓶，使基質(zhì)凝膠均勻分散。

02. 處理基質(zhì)凝膠時(shí)應(yīng)采取哪些預(yù)防措施？
所有操作都應(yīng)在無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行，并使用預(yù)冷的移液槍頭以確保基質(zhì)凝膠均勻分散。

03. 基質(zhì)凝膠應(yīng)如何分裝和儲(chǔ)存以備后用？
解凍后，Arcegel基質(zhì)凝膠可以分裝到多個(gè)預(yù)冷的儲(chǔ)存管中。快速冷凍并儲(chǔ)存以避免反復(fù)凍融。使用過(guò)程中涉及的所有物品都應(yīng)預(yù)冷，包括處理基質(zhì)凝膠時(shí)使用的預(yù)冷移液槍頭、槍頭和管子。

04. 可以使用普通小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)嗎？
使用裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)是有利的，因?yàn)樗鼈儧](méi)有胸腺，導(dǎo)致免疫力較低，對(duì)腫瘤細(xì)胞沒(méi)有免疫反應(yīng)，使得它們更容易形成腫瘤。

05. 腫瘤不生長(zhǎng)可能是什么原因？
可能的原因包括注射的細(xì)胞數(shù)量太少、細(xì)胞活力差，或者細(xì)胞本身不具備腫瘤形成能力，需要更長(zhǎng)的培養(yǎng)時(shí)間。建議使用中等年齡（4-6周）的免疫缺陷小鼠。
 

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