類器官來源細胞

原因：

起始的多能干細胞（hPSC）質量低，可能導致類器官形成效率低；不同種類的類器官活性差異很大，有些類器官本身活性不足，比如甲狀腺癌類器官，只能維持原代，傳代后基本不長。除此以外，公認難養的類器官還有肝癌類器官、前列腺癌類器官。

去除自發分化的細胞，確保接種高質量、未分化的hPSC；對于無法傳代或者傳代困難的類器官，盡量用原代細胞進行實驗或者尋找其他替代方案。

原因：

培養皿表面涂層的種類和質量可能會影響細胞附著的方式。某些涂層可能粘附性過強，導致細胞無法形成3D結構；細胞密度過高、懸浮狀態不良等因素也可能阻礙細胞形成3D結構，使其更傾向于貼壁生長。

選擇適合類器官培養的培養皿和涂層，使用支架、基質或微流控設備，提供適當的微環境，減少細胞貼壁的傾向；通過測試不同的接種密度，確定最佳的細胞接種密度，避免因細胞密度過高而影響懸浮狀態。

原因：

細胞或組織樣本可能被污染，從而影響類器官的形成。

確保無菌操作，避免室內空氣中的氣流和粒子（灰塵和孢子）污染；使用經過滅菌處理的試劑和耗材；定期維護培養箱、生物安全柜等儀器設備。

類器官培養體系

原因：

培養基和生長因子使用不當，可能導致類器官培養失敗。

確保使用高質量的培養基和生長因子；操作時要小心、快速，注意預冷，避免基質膠因為溫度過高而成膠；根據文獻資料和實驗目的選擇合適的培養基和生長因子；培養基和生長因子不宜儲存過久，開封后應盡快使用（有的類器官對培養體系較為敏感，不新鮮的培養體系會影響類器官生長狀態）。

原因：

消化液對類器官傳代的影響主要體現在兩個方面：傳代消化液是否恰當，不合適的酶會造成類器官損傷；放置過久或保存不當的消化液，酶活會逐漸下降，消化類器官需要增加時間，容易導致消化過度，從而使類器官活性受損。

選擇合適的類器官消化液；對消化液進行適當保存，必要時進行分裝。

原因：

基質膠的作用有兩個，其一是起支架作用，維持類器官的3D形態，其二是含有豐富的因子種類，對類器官的生長有促進作用。當基質膠在4℃儲存時間過久，基質膠的粘附性和因子活性均會大大降低，此時的基質膠類器官穹頂結構容易脫離培養板底面而漂浮，同時也難以維持類器官增殖需求。

初次使用時注意分裝，所有分裝均需用預冷的凍存管，迅速分裝并保存，避免多次凍融。避免在4℃儲存過久。

實驗操作問題

原因：

類器官在培養孔中分布不均，影響實驗結果的均一性和可重復性。

接種之前，確保使用多通道移液器上下吹打多次，產生均勻的單細胞懸液。小心將懸液注入孔板中。

原因：

離心條件不當可能會對類器官造成損傷。離心過程中產生的機械應力可能會對類器官細胞造成破壞，這種損傷包括細胞膜的破裂、細胞內部結構的損傷，以及細胞功能的喪失；離心時的溫度對類器官的保存狀態有重要影響，離心溫度過高可能會導致基質膠固化，影響類器官的分離和保存。

建議在4℃的低溫條件下進行離心，以避免熱損傷?；|膠冷化后在進行離心分層時，建議選用水平角離心機，轉速控制200g-300g，溫度設為4℃，時長控制在5分鐘以內。

原因：

離心后的類器官通常分為三層：緩沖液、基質膠、類器官沉淀，正常是保留類器官沉淀層，上面的緩沖液和基質膠棄掉。但如果類器官數量很少，分層后的類器官沉淀層也會很少，只留下最下層的類器官沉淀，容易損失部分原代類器官，導致后期生長速度減慢。

建議同時保留類器官沉淀和基質膠的下2/3，以減少類器官的損失（基質膠層會殘留類器官）。

原因：

槍頭吹打容易對細胞造成機械損傷；吹打力度過大會導致培養基中有氣泡產生，細胞處在氣泡與培養基之間，當氣泡破碎時，細胞瞬間會受到剪切力影響從而導致細胞碎裂。這些都會影響到后續類器官的生長狀態。

為了減少這部分損傷，需要盡量減小吹打力度，只要保證能夠吹下吹散細胞就行。槍頭與細胞層接觸甚至研磨會導致細胞直接死亡，因此在操作時需要控制槍頭與培養板底的間距，避免直接接觸；輕柔操作，避免力度過大產生氣泡。

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