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慢病毒（Lentivirus）是逆轉錄病毒的一種。構建的siRNA / miRNA慢病毒載體，與化學合成的siRNA 和基于瞬時表達載體構建的普通siRNA 載體相比，一方面可以擴增替代瞬時表達載體使用，另一方面，Lentivirus-siRNA 克隆經過慢病毒包裝系統包裝后，可用于感染依靠傳統轉染試劑難于轉染的細胞系如原代細胞、懸浮細胞和處于非分裂狀態的細胞，并且在感染后可以整合到受感染細胞的基因組，進行長時間的穩定表達。特點如下：
1）直接包裝成為假病毒顆粒，對分裂和非分裂細胞均有感染作用，適合RNAi 研究和體內實驗中難于轉染的細胞(比如神經元細胞、干細胞或其它原代細胞)。
2）可以通過簡單方式，在短時間內獲得穩定表達特定基因的多種細胞株。
3）可用于基因敲除、基因治療和轉基因動物研究。
4）無需任何轉染試劑，操作簡便。
5）可以根據客戶需要制備多種標記。
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慢病毒包裝實驗步驟
一、Day1: 10cmdish聚合度90%的HEK293T（每盤大約6x107）細胞按1：1比例傳盤至15cmdish，第二天細胞達到聚合度90%-95%（每盤大約1.5x108），培養基為Gibico高糖DMEM培養基（含10%FBS）。
二、Day2:
1、轉染前2-3個小時換液（含10%FBS，1mM/L不需要加入丁酸鈉？加入的濃度？)
2、按照以下比例配置轉染試劑：
| Mix 1 | 體積 ul | Mix 2 | ? |
| DMEM（無FBS） | 1000 | DMEM（無FBS） | 1000 |
| PEI | 190ul (1ug/ul) | 目的基因質粒 | 25 ug |
| ? | ? | PMD2G | 7.5ug |
| ? | ? | PSPAX2 | 15ug |
Mix 1和Mix 2分別混合后，室溫5-10min, 后將Mix 1和Mix 2混合，室溫30min，加入至15cm細胞培養皿中。（細胞達到聚合度90%，細胞過少會影響轉染效率）
三、Day3: 6h-24h內更換新鮮培養基（含10%FBS），觀察轉染效率并拍照。
四、Day5:72h觀察細胞狀態并拍照。收取上清培養基，過0.45um濾膜，上清培養基加入超速離心管中，配平后離心，25000r，4℃離心1.5h。棄上清，用1ml病毒保存液回溶混勻溶解過夜。
五、Day6：收集病毒分裝、孔稀釋測滴度。
| 取5ul病毒原液加入到45ulDMEM中，混勻后取5ul加入到45ulDMEM中，重復6次；分別做兩組重復 | |||||||
| 病毒原液=A | 45ulDMEM +5ulA=B1 | 45ulDMEM +5ulB=C1 | 45ulDMEM +5ulC=D1 | 45ulDMEM +5ulD=E1 | 45ulDMEM +5ulE=F1 | 45ulDMEM +5ulF=G1 | 45ulDMEM +5ulG=H1 |
| 病毒原液=A | 45ulDMEM +5ul病毒=B2 | 45ulDMEM +5ulB=C2 | 45ulDMEM +5ulC=D2 | 45ulDMEM +5ulD=E2 | 45ulDMEM +5ulE=F2 | 45ulDMEM +5ulF=G2 | 45ulDMEM +5ulG=H2 |
| 將這7個混合液和病毒原液分別取10ul加入到96孔293細胞中（ 每孔約5000個細胞），72H拍照 | |||||||
| 10ulA | 10ulB1 | 10ulC1 | 10ulD1 | 10ulE1 | 10ulF1 | 10ulG1 | 10ulH1 |
| ? | 10ulB2 | 10ulC2 | 10ulD2 | 10ulE2 | 10ulF2 | 10ulG2 | 10ulH2 |
| 102 | 103 | 104 | 105 | 106(NE1,NE2個帶熒光細胞） | 107(MF1,MF2個帶熒光細胞） | 108 | 109 |
| 計算方法,對能觀察到熒光的后兩個孔進行計數，兩組重復取平均值 [(NE1+NE2)÷10+MF1+MF2]÷4×107 | |||||||
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慢病毒感染細胞的實驗步驟
1、鋪板：將對數生長期的細胞消化重懸后，按1*105/L密度接種于12孔板，生長過夜
2、感染：將70-80%鋪滿12孔板中的培養液吸除，換新鮮的培養液，同時加入PBS
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