編者按
貫葉連翹，又名貫葉金絲桃、圣約翰草St. John Wort，是藥用植物中的明星物種，其制劑常被用作抗抑郁癥、失眠、酒精依賴綜合征等病癥的臨床用藥。然而，其潛在毒性及其藥理活性的多樣性機制研究目前還不完善。
今天，我們分享2022年發表在《Front Pharmacol》的一項研究成果——Hypericum lanceolatum Lam.Medicinal Plant: Potential Toxicity and Therapeutic Effects Based on a Zebrafish Model，該研究利用斑馬魚模型，研究了藥用植物貫葉連翹的潛在毒性及其多效性，包括對氧化應激、組織再生、雌激素樣效應、神經生成和代謝紊亂的影響等，驗證了貫葉連翹的抗氧化、促再生、抗脂質積累和促神經生成效果，因此，這種傳統藥用植物作為預防和/或治療代謝紊亂的潛在替代品，具有很大的市場開發前景。
文章題目
Hypericum lanceolatum Lam.Medicinal Plant: Potential Toxicity and Therapeutic Effects Based on a Zebrafish Model
雜志：Front Pharmacol
發表時間：2022年3月11日
作者：Laura Gence, Danielle Femezelian, et al．
01、研究背景
這篇文章主要研究了藥用植物貫葉連翹的多效性。研究工作的目標是：1.確定該植物水提取物在體內的潛在毒性;2.利用幾種斑馬魚模型，研究其可能的生物學特性，包括對氧化應激、組織再生、雌激素樣效應、神經生成和代謝紊亂的影響。
研究首先通過液相色譜-串聯質譜對植物的多酚組成進行了測定，鑒定出綠原酸異構體、槲皮素和山柰酚衍生物作為主要化合物。然后，研究首次評估了貫葉連翹水提取物的毒性，并根據經濟合作與發展組織（OECD）的指南，在斑馬魚胚胎發育的0至96小時后（hpf）確定了最大非毒性濃度（MNTC）。這個MNTC測試也在孵化后的胚胎上進行了2天處理（3至5天發育后，dpf）。
在EASZY實驗中，研究支持了貫葉連翹的抗雌激素效應。在尾部截斷模型中，研究表明貫葉連翹在其MNTC水平下表現出抗氧化特性，促進免疫細胞的募集和組織再生。研究結果還突出了其在代謝紊亂中的有益效果，貫葉連翹能有效地減少過度喂養的幼蟲和成年模型中的脂質積累和體重指數。此外，研究表明貫葉連翹沒有改善高血糖斑馬魚模型中的空腹血糖水平，但令人驚訝的是，它抑制了糖尿病條件下觀察到的神經生成障礙。
總之，這項研究強調了貫葉連翹在體內的抗氧化、促再生、抗脂質積累和促神經生成效果，并支持將這種傳統藥用植物作為預防和/或治療代謝紊亂的潛在替代品。
02、主要研究結果
1. 水提取物中的總多酚含量
通過改良版的Folin-Ciocalteu比色法，使用96孔微孔板技術對貫葉連翹水提取物的總多酚含量進行了測定，結果以每克干重的沒食子酸當量(GAE)表示。
實驗中，貫葉連翹水提取物與稀釋的Folin-Ciocalteu試劑和碳酸鈉溶液混合后，在50°C下孵育5分鐘，隨后冷卻并測量760nm處的吸光度。貫葉連翹草藥茶在傳統醫學中被用于減少炎癥和糖尿病，其水提取物的多酚含量測定顯示，每克干重含有103.2 ± 6.1 mg GAE，這與其作為多酚類生物活性分子來源的描述相符。
2. 體外DPPH自由基清除活性
貫葉連翹水提取物的化學抗氧化能力通過DPPH方法進行評估，使用抗壞血酸作為陽性對照，并計算了“IC50-like”值來表示抗氧化能力。
實驗結果顯示，其DPPH實驗的“IC50-like”值為0.86 ± 0.1 g/L，是抗壞血酸的約1/10。盡管DPPH實驗不具有藥理學相關性，但提供了貫葉連翹水提取物具有潛在抗氧化化合物的證據。
3. 多酚鑒定與定量
采用超高效液相色譜-串聯質譜技術，對貫葉連翹水提取物進行了多酚類物質的鑒定和定量分析。通過LC-MS/MS分析，鑒定出貫葉連翹含有23種多酚類化合物，包括酚酸和黃酮醇，其中咖啡酰奎寧酸異構體(綠原酸)、槲皮素苷和山柰酚苷是主要的多酚成分。
定量分析顯示，貫葉連翹中咖啡酰奎寧酸異構體的含量高達83.4 mg/g干重，占已鑒定總化合物的65%。采用標準物質制備校準曲線，通過線性回歸計算確定了分析物的濃度，并以mg/g干重的形式表達。實驗結果表明，貫葉連翹水提取物富含多種多酚類化合物，具有潛在的健康益處。
圖1
4. 魚胚急性毒性試驗
根據OECD指南236，通過Fish Embryo Acute Toxicity (FET)測試對貫葉連翹水提取物的毒性進行了評估，選用不同濃度處理新受精斑馬魚胚胎至96小時后，并觀察胚胎發育情況。實驗中，每天對胚胎進行顯微鏡下的分析，評估凝血、體節形成、尾部分離和心跳等指標，以及觀察形態畸形和孵化情況。在3天斑馬魚幼體上進行了額外的毒性測試，以排除胚胎期毒性，并在2天內分析了幼體的生存率和形態缺陷。
在0.3125 g/L濃度下，未觀察到胚胎和幼體的形態畸形或死亡率，因此將此濃度定義為最大非毒性濃度（MNTC），并用于后續研究。為了進一步驗證MNTC的非毒性效果，對貫葉連翹水提取物進行了基因表達分析，包括肝毒性、心毒性、腎毒性標志物以及受糖皮質激素調控的基因。
使用3至5天斑馬魚幼體進行的RT-qPCR分析顯示，MNTC處理2天并未顯著誘導肝毒性、心毒性、纖維化和內分泌干擾標志物的表達。同時，對轉基因tg(GFAP::GFP)斑馬魚幼體進行了研究，該轉基因幼體的神經干細胞表達GFP，貫葉連翹提取物處理后，GFP熒光強度在脊髓水平沒有變化。這些結果支持了貫葉連翹水提取物在MNTC濃度下的安全性，并為進一步的生物學效應研究提供了基礎。
圖2、3
5. 內分泌活性物質檢測
為了評估貫葉連翹潛在的雌激素活性，根據OECD TG 250指南，使用EASZY檢測法對新受精的cyp19a1b-GFP轉基因斑馬魚幼體進行了處理，并在28°C的孵化器中從0至4天斑馬魚幼體發育階段( dpf)進行暴露。
實驗中，每天更新介質，使用不同濃度的貫葉連翹水提取物處理幼體，并與陰性對照(養殖水)和陽性對照(17α-乙炔雌二醇EE2 0.05納摩爾)進行比較。暴露結束后，收集轉基因斑馬魚幼體進行熒光成像分析，每次測試條件分析26至38個幼體，共進行了兩次獨立實驗。
在第三次實驗中，評估了單獨的雌二醇(E2)暴露或與貫葉連翹共暴露(0.156 g/L)對幼體的影響。實驗結果顯示貫葉連翹水提取物以濃度依賴性方式下調了基礎GFP表達，而陽性對照組觀察到GFP表達的顯著上調，驗證了實驗的有效性。進一步的共暴露實驗表明，貫葉連翹水提取物能顯著降低E2誘導的GFP表達，證實了其對雌激素受體依賴性cyp19a1b基因表達的負向干擾能力。
目前尚不清楚貫葉連翹抗雌激素效應的確切機制，如酚類化合物是否作為拮抗劑結合到雌激素受體，或者是否激活了導致與雌激素信號通路負向串擾的信號通路。所有實驗都經過有效性標準的檢查，以確保測試結果的準確性和可靠性。
圖4
6. 對斑馬魚進行行為分析
根據先前研究推薦，為了更好地評估運動能力，選擇6天斑馬魚幼體進行運動行為分析，并使用Viewpoint Zebrabox系統進行監測。
3天大的斑馬魚幼體開始被孵化在E3培養基（對照組）或貫葉連翹水提取物的最大非毒性濃度（MNTC，0.3125 g/L）中，每天更換處理液，持續3天。在6天時，幼體經過10分鐘適應期后，在暗環境中記錄10分鐘內的不活動、小活動和大活動狀態。
實驗結果顯示，對照組和處理組幼體在不活動、小活動、大活動和總移動距離上沒有顯著差異。這些結果表明，在MNTC濃度下貫葉連翹水提取物對斑馬魚幼體的運動行為沒有影響，揭示了MNTC沒有神經行為毒性。該實驗作為對MNTC缺乏毒性的最后驗證，監測了水提取物對幼體運動行為的潛在影響，確認了MNTC的安全性。
圖5
7. 斷尾再生氧化應激、免疫細胞募集和組織再生研究
成年斑馬魚和3天斑馬魚幼體首先使用0.02%三卡因(MS-222)進行麻醉，隨后進行尾部截斷手術。成魚尾部截斷至總尾長的50%，幼體則在不損傷脊索的情況下，在脊索附近進行切割。
在成年斑馬魚上進行了氧化應激實驗，使用DCFH-DA和DHE熒光探針檢測氧化應激反應，貫葉連翹水提取物預處理顯示了抗氧化特性。3天斑馬魚幼體用于免疫細胞募集實驗，貫葉連翹水提取物處理顯著增加了損傷部位的Mpo陽性中性粒細胞和Lcp1陽性巨噬細胞數量。
成年魚和幼體在尾部截斷后使用貫葉連翹水提取物處理，連續觀察14天和7天，監測再生過程。貫葉連翹水提取物在成年斑馬魚和幼體中顯示出促進組織再生的特性，特別是在炎癥反應和再生過程中的調節作用。通過與地塞米松的共處理實驗，揭示了貫葉連翹可能作為炎癥過程的調節劑。地塞米松單獨處理抑制了尾部再生，而貫葉連翹的存在則改善了這一效果，表明貫葉連翹對炎癥反應的調節作用。
實驗結果表明，貫葉連翹水提取物通過促進抗氧化反應和免疫細胞浸潤，改善了損傷部位的愈合。綜合結果揭示了貫葉連翹水提取物在組織再生中的益處，證實了其加速尾部再生的潛力，為貫葉連翹的體內抗氧化和抗炎效果提供了實驗依據。
圖6-9
8. 代謝性疾病相關的病理紊亂
成年斑馬魚通過在111 mM的D-葡萄糖溶液中浸泡14天來誘導高血糖狀態，貫葉連翹水提取物以MNTC(0.3125 g/L)處理，以探究其對高血糖的潛在影響。
實驗中，斑馬魚被分為正常飼養組和高脂飲食(DIO)組，以及高脂飲食補充貫葉連翹水提取物(DIO + HL)組，通過不同的飼養方式來模擬肥胖模型。在成年斑馬魚的DIO模型中，貫葉連翹水提取物處理顯著降低了BMI，并且似乎減輕了體重，顯示出“抗肥胖”的特性。
在慢性高血糖模型中，貫葉連翹水提取物未能降低由高葡萄糖環境引起的血糖升高。慢性高血糖減少了神經干細胞(PCNA陽性細胞)的數量，表明高血糖可能損害了神經發生。7天斑馬魚幼體被分為正常飲食組、高脂飲食(HFD)組和高脂飲食補充貫葉連翹水提取物(HFD + HL)組，使用不同的飼料來誘導肥胖，并用油紅O(ORO)染色檢測脂肪含量。
實驗結果顯示，貫葉連翹水提取物處理的幼體相對于過度喂養的幼體顯示出顯著減少的ORO染色，表明貫葉連翹可能具有減少脂肪積累的效果。貫葉連翹水提取物處理能夠防止慢性高血糖導致的神經發生減少，顯示出對神經生成的保護作用。這些實驗結果表明貫葉連翹水提取物可能對代謝性疾病相關并發癥具有積極影響，具有潛在的抗肥胖和神經保護特性。
圖10-12
03、編者點評
本文首次報告了使用可靠的斑馬魚毒性測試來評估貫葉連翹水提取物的毒性。分析結果表明，貫葉連翹提取物中含有酚酸（綠原酸異構體）和黃酮類化合物（槲皮素、山柰酚衍生物）作為主要成分。研究表明，貫葉連翹在最大非毒性濃度(MNTC)下對斑馬魚具有強大的抗氧化、促再生、抗脂質積累和神經生成特性。
此外，研究結果顯示貫葉連翹水提取物可能對抗糖尿病和肥胖相關并發癥具有潛在效果，是提供貫葉連翹非毒性和潛在治療效果證據的第一步。為了闡明傳統藥用植物在預防和/或治療代謝性疾病中的活性機制，需要進一步的研究，使用臨床前嚙齒動物模型。最后，考慮到貫葉連翹的抗雌激素效應，在懷孕或雌激素依賴性疾病的情況下需要特別注意。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”多維生物技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！