類器官消化是類器官培養中的關鍵步驟，因其復雜的細胞結構和多樣的細胞類型，使得類器官消化不同于普通細胞一樣容易進行，消化不下來、離心后沒有沉淀等，這些常見問題應該如何解決呢？接下來就讓我們一起看看吧！

01 什么時候可以進行消化？

類器官消化的時機很重要。消化時機過早、過晚都不利于類器官繼續生長。

類器官大小：當類器官直徑達到200-500 μm或類器官生長速度明顯減慢時，通常需要傳代。

培養基消耗：培養基變黃，說明需要傳代。

類器官結構變化：如果類器官結構開始變得不規則或出現中心壞死，應盡快傳代。

類器官脫落：部分類器官和細胞從Matrigel基質中脫落，漂浮在培養基中，需要傳代。

細胞過度遷移覆蓋基質膠：細胞已經完全覆蓋了基質膠的邊緣，甚至整個培養皿底部都被遷移的類器官細胞占據，導致基質膠難以被觀察到。這可能提示細胞的遷移能力過強，或者培養環境促使細胞過度生長和擴散，需要傳代。

02 出現這些問題如何解決？

01 消化不下來

類器官在消化后仍然存在較大的細胞團塊，無法完全解離成單細胞懸液。

原因分析：

消化酶不發揮作用：消化酶的濃度、活性或作用時間不足，消化過程中溫度、pH值等條件控制不當，無法有效降解類器官中的細胞外基質（ECM）和細胞間連接。

類器官成分復雜：不同來源的類器官細胞外基質成分差異較大，某些成分對消化酶的敏感性較低，導致消化困難。

解決方法：

根據類器官的類型和來源，選擇合適的消化酶。對于富含膠原蛋白的類器官，可以使用膠原酶；對于干細胞含量較高的類器官，建議使用溫和的中性蛋白酶。

對于成分復雜的類器官，可以采用分步消化的方法。先用一種酶進行初步消化，去除部分細胞外基質，再用另一種酶進行進一步消化，逐步解離細胞。

確保消化過程中的溫度、pH值等條件符合酶的最佳活性范圍。根據實驗需求合理調整消化時間，避免消化不足或過度。

02 離心后無沉淀

正常離心后應該分為緩沖液、基質膠和類器官沉淀三層，但實際操作中有時會出現這種情況，基質膠和類器官沉淀形成混懸液，無法完全分離。

原因分析：

類器官數量少，體積小，降溫時間不夠，基質膠粘稠等。

解決方法：

加盡可能多的緩沖液，稀釋基質膠類器官混合物，能促進分離。

將基質膠類器官混合物放于-20℃，5min（注意：如果冰箱冷凍效果強，冷凍3min），加速基質膠液化，能促進分離。

離心機的選擇非常重要，水平角離心機相比固定角離心機更利于基質膠和類器官分離。

離心機的溫度最好是4℃（可避免基質膠固化），離心轉速可適當提高（最高不要超過500g），離心時間可適當加長（最常不超過10min）。

如果按照上述方法改善基質膠和類器官仍未分離，可保留基質膠類器官混懸物下2/3傳代（上1/3基本是原代細胞雜質或死細胞）。

03 細胞陷入“僵持”狀態

細胞消化后培養處于一種“僵持”狀態，既無法正常增殖，也難以死亡。

原因分析：

如果使用的胰蛋白酶、膠原酶等消化酶濃度過高，可能會對細胞造成過度損傷，例如，胰蛋白酶濃度過高會破壞細胞表面的蛋白質結構，影響細胞的附著和生長信號傳導。消化時間過長，也會使細胞表面的受體和黏附分子過度降解，影響類器官正常生長。操作過程中的機械損傷也有可能導致此類情況發生。

解決方法：

根據類器官的來源細胞類型，選擇合適的消化酶，并嚴格按照推薦濃度和作用時間進行操作。對于一些干細胞來源的類器官，可能需要使用低濃度的胰蛋白酶（如0.05%）來避免損傷。

在消化過程中，吹打力度要輕柔。避免使用過大的力量吹打細胞，以免產生剪切力損傷細胞。

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