編者按
建立腫瘤移植模型常用小鼠，但因為實驗成本、周期和小鼠移植瘤模型自身的一些局限而讓斑馬魚移植瘤模型進入大家的視野，已有利用斑馬魚幼魚來做的短期異種移植瘤模型（zPDX），但實驗周期較短、口服給藥劑量不可控等限制了zPDX的發展。如何解決這些問題，推動zPDX技術的進一步發展？
今天我們來解讀一項由美國麻省總醫院研究人員于2019年6月13日發表在《Cell》(IF=64.5)的經典研究——《Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Response in Immunodeficient Zebrafish》，研究人員利用免疫缺陷的突變斑馬魚品系來進行異種腫瘤抑制模型的構建，可實現長期的培養和觀察，更好地模擬了腫瘤在人體的生長情況，給藥后也可實現長期的觀察，更真實的評價了抗腫瘤藥物的殺傷效果；還創新性地把斑馬魚移植瘤模型可視的特點推進到單細胞分辨率，實現了在體觀察單細胞層面的細胞動態生理過程。
文章題目
Visualizing Engrafted Human Cancer and Therapy Response in Immunodeficient Zebrafish
作者：C Yan，DC Brunson，Q Tang，D Do，NA Iftimia，JC Moore，MN Hayes，AM Welker，EG Garcia，TD Dubash
通訊單位：美國麻省總醫院
雜志：Cell
影響因子：64.5/Q2
翻譯：韓成
文章鏈接：10.1016/j.cell.2019.04.004
01、研究背景
建立腫瘤移植模型，常用的實驗動物是免疫缺陷的小鼠，但小鼠養殖成本較高，且對養殖空間需求較大，經濟性較差。且小鼠模型體表被毛，活體觀察需借助基因編輯、染色和活體成像設備，操作相對繁瑣。經濟性和活體觀察復雜的問題需要開發新的移植瘤模型來做技術補充。
斑馬魚已成為繼小鼠和大鼠以后的第三大脊椎模式生物，早在2017年就有研究團隊利用斑馬魚的幼魚構建異種移植瘤模型（zPDX）。該模型發揮了斑馬魚幼魚通體透明的優勢可以在體觀察腫瘤細胞的生長和血管的新生，同時經濟性也有很大提升。但隨著幼魚逐步發育，免疫系統逐漸建成，留給實驗的免疫缺陷的窗口期較短，斑馬魚幼魚的zPDX模型只能實現短期（2-3 d）的給藥觀察，把藥物融入養殖水體環境無法很好模擬口服給藥，且給藥劑量不可控。
為解決這些問題，作者利用免疫缺陷的成年斑馬魚進行腫瘤移植，并和小鼠移植瘤模型對比，驗證了方法的可行性，隨后作者對比斑馬魚移植瘤模型和小鼠移植瘤模型的藥物治療效果，驗證了方法用于藥物抗腫瘤效果評價的可靠性。作者選擇橫紋肌肉瘤這一兒童高發的軟組織肉瘤，在斑馬魚zPDX模型上篩選治療藥物，并將腫瘤細胞移植到斑馬魚的眼周肌肉組織內，利用斑馬魚透明可視的特點，在單細胞層面實現了腫瘤細胞動態生理過程的觀察。
02、研究結果
多種實體瘤細胞系移植到斑馬魚成魚體內并與小鼠結果對比
作者把多種實體瘤腫瘤細胞移植到NSG免疫缺陷鼠和免疫缺陷斑馬魚上，通過成瘤大小，病理染色、免疫組化染色、增殖和凋亡染色來對比評估腫瘤細胞移植到免疫缺陷斑馬魚體內的可行性。
移植后，根據作者的數據，移植后的成功率比較高，85%以上的斑馬魚移植后可以正常存活。應該說通過和“金標準”的小鼠移植瘤模型進行多角度的對比，充分說明了斑馬魚移植瘤模型的可行性。其中Desmin是結蛋白，可作為多種肉瘤的病理marker；S100是神經特異性蛋白，作為神經源性腫瘤或者黑色素瘤的病理特征marker。
圖1. 多種腫瘤細胞系移植效果的對比確認
患者來源的腫瘤細胞移植入斑馬魚確認移植效果
作者開發出斑馬魚的移植瘤模型，也想發揮它臨床前預測的價值，前期用腫瘤細胞系是為了驗證體系的可行性，但腫瘤患者的異質性和腫瘤微環境是腫瘤細胞系移植模型無法模擬出來的。
所以，患者進行了包括膠質瘤、黑色素瘤、橫紋肌肉瘤和乳腺癌在內的多種患者來源的腫瘤細胞的斑馬魚移植。作者在腫瘤細胞系移植的時候，用的都是慢病毒轉染過的腫瘤細胞系，就是把綠色熒光蛋白的基因整合進細胞系的基因組，然后細胞就能表達綠色熒光蛋白，可以在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光的腫瘤細胞。
在做患者來源的腫瘤細胞的移植時，作者用了綠色熒光的腫瘤細胞或者用了熒光染料來示蹤腫瘤細胞。通過HE染色結果、Ki67增值性marker染色和Tunel染色凋亡情況，作者說明了患者來源的腫瘤細胞可以成功移植到斑馬魚體內，顯示了zPDX模型的臨床前運用價值。
圖2. 患者來源腫瘤細胞移植入斑馬魚后確認效果
斑馬魚眼周肌肉組織移植橫紋肌肉瘤后的單細胞示蹤研究
作者接下來還是發揮轉基因品系斑馬魚的特點，作者用的是色素敲除的斑馬魚，身體很多部位，即便是到了成魚階段，依然有較高的透明度。
作者想研究的就是腫瘤的異質性，腫瘤組織中，有很多不同功能的細胞，比如有增殖類型的，有侵襲和轉移能力的，有處在靜默狀態，既不轉移也不增殖的，了解這些細胞的大致構成和比例，對于治療方案的選擇有很大意義，所以作者就嘗試在斑馬魚上實現在體觀察的單細胞分辨率的呈現。
圖3. zPDX可實現單細胞分辨率的成像
作者為了觀察方便，選取了斑馬魚眼周的肌肉組織進行腫瘤細胞移植，這一塊呈現比較均勻的透明。作者選擇的癌腫是橫紋肌肉瘤，而且作者對這種腫瘤細胞提前進行了編輯，讓它可以表達一種光轉化蛋白，在uv光照射下，這種蛋白會從綠色熒光轉變成紅色熒光。所以，這就保證了作者只要對單個細胞進行光暴露，就可以特異性的標記單個細胞，隨后利用斑馬魚可視的特點，可以在體觀察單個細胞的動態過程。
文中標記了3個細胞，利用這種光轉化蛋白，經過單細胞的光照射以后讓他們從綠色熒光變成了紅色熒光，那就可以從細胞群體中持續的示蹤這3個單個細胞，作者為了區分他們，后期給他們換了偽彩，標記成紅色、黃色和藍色3個個體細胞，然后每24h拍照統計，并畫出了每個細胞的動態過程普圖。可以看到腫瘤細胞會展現出3種狀態，分別是靜默、轉移和增殖；比如標記紅色的細胞在48小時分裂后，得到的兩個子細胞，隨后一個靜默，一個遷移。黃色標記的細胞，增殖比較旺盛。
作者之后還對細胞的比例做了統計，就是圖中的柱狀圖，可以看到在這兩種分型的橫紋肌肉瘤中，都有這三種類型的細胞，并且所占比例相似。
利用橫紋肌肉瘤zPDX模型進行抗腫瘤藥效評價和在小鼠模型上確認
作者基于之前報道過的動物實驗數據，對橫紋肌肉瘤移植的斑馬魚做了治療驗證。
移植一周后，作者開始給藥，設置了兩個單藥和一個組合藥的藥物組，每隔7天給藥一次，結合腫瘤細胞熒光強度、HE染色、KI67增殖染色和TUNEL凋亡染色，顯示出聯用奧拉帕尼（olaparib）和替莫唑胺（temozolomide）治療橫紋肌瘤的效果更佳，實驗終點幾乎看不到腫瘤細胞。且在小鼠身上作者也做了驗證，同一套組合給藥方案在小鼠移植瘤模型上也驗證了抗腫瘤的效果。最終為臨床前階段腫瘤治療提供新的可靠的篩選模型。
圖4. zPDX模型進行抗腫瘤藥效評價
圖5. 基于zPDX的結果在小鼠模型上做確認
藥物作用機制研究
作者把前期建立起來的單細胞分辨率的成像技術運用到機制探究中，作者采用一種染料，可以指示不同的細胞周期。
作者把腫瘤細胞移植到斑馬魚的眼周肌肉組織中，腫瘤移植后給藥，就是剛剛篩選出有效的組合治療方案，然后連續觀察7天，可以看到阻滯在G2期的細胞比例逐漸增加，且對比單藥組，組合給藥組G2期細胞更多，說明藥物阻斷了正常的腫瘤細胞增殖的細胞周期，使更多的細胞停滯在G2期。
圖6. 藥物作用使移植的橫紋肌肉瘤細胞阻滯在G2期
03、編者點評
就這篇文章而言，工作創新性是很強的，但機制研究還有待加強。作者驗證了斑馬魚的PDX模型也像小鼠模型一樣，可以做一些免疫組化、HE染色、細胞染色等簡單的機制相關研究，顯示出在科研端的應用潛力，作者沒有更進一步的揭示藥效背后的分子生物學機制，這些工作留待后人，事實上這些工作近幾年都有科研人員去做了。后續我們會持續來和大家分享相關的內容。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特類器官平臺已建立200多種斑馬魚模型及多種類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！
參考文獻
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