編者按
近年來，小腦（cerebellum, CB）研究一直備受關注。已有研究表明小腦在協調機體運動、維持平衡中發揮著關鍵作用，并對語言、空間處理、工作記憶、情緒處理等認知功能中產生著重要影響。然而，一些常見的轉移性兒童腦腫瘤髓母細胞瘤及其他小腦疾病，包括自閉癥、小腦共濟失調，與小腦皮層主要輸出神經元浦肯野細胞（Purkinje cell）的退化有關。這些疾病主要在小鼠模型中進行研究，但小鼠模型無法完全重現人類疾病的表型，因此，迫切需要開發一種全人源細胞培養系統，能夠產生功能性浦肯野細胞。
今天，我們分享美國南加州大學Keck醫學院Giorgia Quadrato團隊在Cell Stem Cell上發表的一項研究——《Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells》，該研究構建了一種人類小腦類器官（hCerO），可以讓包含浦肯野細胞在內的功能性小腦細胞，在體外人源三維環境中長期健康存活和成熟，對闡明小腦發育調控網絡、疾病的細胞特異性機制等有著重要的意義。
文章題目
Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells
雜志：Cell Stem Cell（IF=23.2）
發表時間：2024年1月4日
作者：Giorgia Quadrato等
研究人員及單位：南加州大學Keck醫學院
01、研究背景
近年來，小腦（the cerebellar）在認知功能中的作用越來越受到關注，包括語言、空間處理、工作記憶、執行功能和情感處理，以及在運動行為中的作用。在所有哺乳動物中，小腦最初來源于中腦-后腦邊界的翼板（背側）菱形板1（r1）區域。r1由兩個不同的祖細胞區組成，包括PTF1A+/KIRREL2+心室區（VZ）和ATOH1+菱形唇（RL）。VZ產生GABAergic神經元，包括浦肯野細胞、分子層中間神經元（MLIs）和小腦深部核（抑制性小腦核[iCNs]），而更多位于背側的RL產生谷氨酸能神經元，包括顆粒細胞（GCs）、單極刷狀細胞（UBCs）和大的小腦深部投射神經元（興奮性小腦核[eCNs]）。
盡管小腦發育早期階段在物種間具有保守性，但與非人類哺乳動物相比，人類小腦具有一些特有的特征，包括神經元亞型比例改變和小腦小葉復雜性增加。此外，人類小腦中有來自菱唇（Rhombic lip）的特有神經祖細胞，而菱唇的異常發育與多種小腦疾病有關，包括Dandy-Walker畸形、小腦蚓部發育不良，以及最常見的轉移性兒童腦腫瘤髓母細胞瘤，其他小腦疾病，包括自閉癥、小腦共濟失調，與小腦皮層主要輸出神經元浦肯野細胞（Purkinje cell）的退化有關。這些疾病主要在小鼠模型中進行研究，但這些動物模型無法完全重現人類疾病的表型。例如，小鼠模型無法重現在共濟失調性毛細血管擴張癥患者中觀察到的浦肯野細胞丟失表型。因此，迫切需要開發一種全人源細胞培養系統，能夠產生功能性浦肯野細胞。
在這項研究中，研究團隊構建了一種人類小腦類器官（hCerO），能夠發育出胎兒小腦復雜的細胞多樣性，包括在此研究之前從未在體外生成的人類特異性菱唇（Rhombic lip）祖細胞群。培養的2個月大的hCerO形成獨特的細胞結構特征，包括層狀組織層，并在抑制性和興奮性神經元之間建立功能連接，顯示協調的神經網絡活動。長期培養hCerO可以使浦肯野細胞存活和成熟，這些浦肯野細胞顯示了功能性神經元的轉錄組學和電生理特征，解決了該領域的長期挑戰。
圖形概要
02、研究成果
1. 人類小腦類器官（hCerO）展示與人類小腦相似的復雜性：
首先，研究者為了建立一個可重復的小腦體外模型，構建了一種基于調節體內峽部（小腦的發源地）發展所需的信號分子的類器官方法。之前的研究表明在體外構建中腦/后腦包含了WNT和FGF8信號的激活。因此，為了促進神經外胚層向小腦命運分化，研究人員同時用雙SMAD抑制劑Noggin和SB43154228和典型的WNT通路激活劑CHIR-99021處理細胞聚集體。第4天，加入FGF8b，確定中腦-后腦邊界，抑制中腦的發育，重建與體內相似的峽部結構。
在這個構建方案下培養30天，hCerOs形成了空間分離的心室（KIRREL2）和RL（ATOH1）祖細胞區。進一步研究者對培養了2個月的hCerOs進行單細胞RNA測序，發現培養的小腦類器官與受孕后12周以及24周的小腦組織具有高度的相似性。同時聚類結果發現hCerOs表達浦肯野細胞的經典marker（SKOR2, RORA, FOXP2, and CALB1）。以上結果表明，培養的hCerOs與人類的小腦相似，同時含有浦肯野細胞。
圖1
2. 菱形唇（RL）亞區的鑒定：
人類的RL主要分為心室區和心室下區（RLvz和RLsvz），為了確定培養的hCerOs是否存在心室區以及心室下區，研究者對RL的細胞進行聚類，然后將其與人類發育CB數據集中1018個具有RL身份的細胞整合。
研究者觀察到，聚類的細胞簇與人類數據集的RLvz和RLsvz簇有很好的相關性，這表明培養的類器官中存在這兩個祖細胞群體。
圖2
3. hCerO顯示層狀組織層：
經過2個月的培養，hCerO形成獨特的細胞結構特征，包括層狀組織層，并在抑制性和興奮性神經元之間建立功能連接，顯示協調的網絡活動，可以形成神經功能網絡。
圖3
4. 在長期的培養中hCerO具備成熟的神經網絡活動：
為了進一步探究培養的hCerO是否存在自發的神經網絡活動，研究者采用雙光子顯微鏡以及GCAMP6病毒進行鈣成像，結果發現培養的hCerO存在自發的神經元活動。
接著，研究者研究了長期培養是否會導致神經網絡活動的改變，對培養2個月以及6個月的hCerO進行比較，結果發現長期培養會增強hCerO中興奮性神經元以及抑制性神經元的功能鏈接。這些結果為使用hCerOs來模擬小腦微環路發育失衡以及功能損傷提供了基礎。
圖4
5. 在長期培養中hCerO出現成熟且有功能的浦肯野細胞：
由于功能成熟的浦肯野細胞從未在全人培養系統中獲得過，因此研究者聚焦于浦肯野神經元的功能。研究者在培養6個月的hCerO先發現了表達經典marker（PCP2,DAB1, RORA, and FOXP2）的浦肯野細胞，并進一步通過電生理的手段進行功能驗證，結果發現浦肯野細胞具備與體內相似的獨特電生理特性。
圖5
03、編者點評
綜上所述，研究人員構建了一種人類小腦類器官（hCerO），能夠發育出胎兒小腦復雜的細胞多樣性。培養的2個月大的hCerO形成獨特的細胞結構特征，包括層狀組織層，并在抑制性和興奮性神經元之間建立功能連接，顯示協調的神經網絡活動。長期培養hCerO可以使浦肯野細胞存活和成熟，這些浦肯野細胞顯示了功能性神經元的轉錄組學和電生理特征，解決了該領域的長期挑戰。
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