編者按
肌肉萎縮發生在自然衰老和疾病狀態下，肌肉細胞凋亡被認為是肌肉萎縮的主要原因之一，但最近的研究表明，肌肉細胞在肌肉萎縮過程中不會凋亡。
今天，我們分享2025年2月4日由澳門大學健康科學學院羅茜教授團隊在Advanced Science上發表的題為“FRET-Based Sensor Zebrafish Reveal Muscle Cells Do Not Undergo Apoptosis in Starvation or Natural Aging-Induced Muscle Atrophy”的最新研究成果。該研究通過構建由饑餓和自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型，表明盡管在饑餓或衰老誘導的肌肉萎縮期間肌肉質量會大大減少，但肌肉細胞不會因凋亡而死亡，而是通過自噬保持存活，為肌肉萎縮機制探究提供了新的見解，有利于推動肌肉萎縮相關疾病的治療。
研究結果顯示，兩種模型中肌肉細胞直徑均顯著減小，但未觀察到肌肉細胞凋亡。在饑餓模型中，肌肉細胞核數量保持恒定，肌肉組織中巨噬細胞數量未增加，進一步證實肌肉細胞未死亡。轉錄組分析表明，凋亡通路下調，而自噬和蛋白質降解通路上調。
文章題目
FRET-Based Sensor Zebrafish Reveal Muscle Cells Do Not Undergo Apoptosis in Starvation or Natural Aging-Induced Muscle Atrophy
雜志：Advanced Science（IF=14.3）
發表時間：2025年2月4日
作者：賈皓、吳仁飛、楊紅梅、羅茜教授等
單位：澳門大學健康科學學院等
01、研究亮點
• 將一種基因編碼的蛋白熒光探針特異性地表達在斑馬魚的肌肉組織中，并構建了饑餓與自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型開展雙模型驗證，實現了肌肉細胞凋亡的實時動態觀察；
• 首次揭示了肌肉細胞在饑餓和自然衰老引起的肌肉萎縮中并不會死亡，而是通過自噬保持存活，重新定義肌肉萎縮的分子機制；
• 發現自噬（LC3-II表達上調）、線粒體自噬（mitophagy）和泛素-蛋白酶體系統（ubiquitin-proteasome）是肌肉萎縮的核心通路，強調了自噬和蛋白質降解的核心地位，為開發營養干預或靶向自噬的藥物提供了依據。
02、研究背景
肌肉萎縮是指肌肉質量和肌肉力量的喪失，其主要誘因包括衰老、缺乏運動、饑餓、神經損傷及某些疾病，如腫瘤和庫欣病等。肌肉萎縮發生機制主要包括：蛋白質合成減少、降解增加；肌肉干細胞耗竭；肌肉細胞死亡等。
與前兩種機制不同，肌肉細胞死亡，尤其是凋亡，在肌肉萎縮中的作用頗具爭議。已有多項研究證實肌肉萎縮過程中會發生肌肉細胞凋亡。在衰老動物的肌肉組織中，觀察到氧化損傷、線粒體功能障礙、caspase激活及其他凋亡標志物升高等。通過脫氧核苷酸末端轉移酶介導的dUTP缺口末端標記(TUNEL)技術發現，成年兔骨骼肌在缺乏運動2-6天后，肌肉細胞凋亡增加。
更多的研究表明，在廢用性肌肉萎縮中，骨骼肌活性氧水平、caspase-3活性及TUNEL信號顯著升高?；铙w成像及TUNEL法檢測顯示，肌肉細胞線粒體損傷和細胞凋亡導致小鼠神經源性肌肉萎縮。腫瘤細胞來源的外泌體等可以通過激活caspase-3和細胞凋亡來誘導肌肉萎縮。在饑餓誘導的肌肉萎縮中，肌肉組織內檢測到活化的caspase-3。
然而，最近的多項研究認為，小鼠神經源性肌肉萎縮或昆蟲節間肌誘導的肌肉萎縮中，均未發生肌肉細胞凋亡。這可能有一部分原因是由于肌肉細胞的多核特性及龐大的體積造成的，這使得與其他組織中的單核細胞相比，鑒定和表征肌肉細胞的凋亡更加困難。
本研究旨在利用斑馬魚活體成像技術，探究肌肉細胞凋亡是否是斑馬魚肌肉萎縮的主要原因。為了檢測肌肉細胞凋亡，研究人員構建了轉基因斑馬魚Tg(mylz2:sensor C3)，將一種基因編碼的蛋白熒光探針特異性地表達在斑馬魚的肌肉組織中。前期研究已表明，該探針在癌細胞和斑馬魚細胞存活時呈綠色熒光，而在caspase-3激活的凋亡細胞中則變為藍色熒光。
研究發現，Tg(mylz2:sensor C3)斑馬魚可通過單細胞分辨率的顏色變化來檢測肌肉細胞凋亡，并且可用于長期追蹤斑馬魚單個肌肉細胞的凋亡情況。通過構建饑餓和自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型，研究人員發現，盡管肌肉質量顯著減少，但肌肉細胞并未通過細胞凋亡而死亡。
03、研究結果
1. 可視化追蹤斑馬魚肌肉細胞凋亡
為了長期追蹤斑馬魚肌肉細胞凋亡，研究人員將一種基因編碼的蛋白熒光探針特異性地表達在斑馬魚的肌肉組織中。該探針在癌細胞和斑馬魚細胞存活時呈綠色熒光，而在caspase-3激活的凋亡細胞中則變為藍色熒光。
凋亡誘導藥物Raptinal處理斑馬魚后，觀察到明顯的TUNEL陽性信號和藍色肌肉細胞。自然發育過程中少量的凋亡肌肉細胞亦可以被熒光探針檢測到，該探針斑馬魚還可以用來跟蹤巨噬細胞對凋亡細胞的吞噬清除。
圖1
研究發現，在壓力條件下及正常發育過程中，Tg（mylz2:sensor C3）斑馬魚可用于可視化追蹤肌肉細胞凋亡情況。在先前研究中，研究人員觀察到在5-10分鐘內，藍色凋亡皮膚、間質或神經元細胞可以快速分解成凋亡體；在caspase-3激活后，凋亡肌肉細胞的形態可以維持至少1小時乃至更長時間。通過為期兩周的跟蹤監測發現，發育過程中的斑馬魚，只有極少數肌肉細胞通過凋亡而死亡。
圖2
2. 構建饑餓誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型
研究人員構建了饑餓誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型，將受精后5天（dpf）的斑馬魚分兩組實驗，結果表明，在5dpf時，饑餓組斑馬魚的游泳速度比對照組低78%。為證實5天的饑餓會誘發肌肉萎縮，研究人員對斑馬魚肌肉組織進行了三維成像，并測量肌肉組織橫截面積。結果表明，饑餓誘導后，斑馬魚肌肉組織明顯減小。饑餓組的面積比對照組低25%，比5dpf時低30%；饑餓組的肌細胞直徑比對照組低40%，比5dpf時低37%。
進一步測量在饑餓治療前后2種常見肌肉萎縮標志物——MuRF1和Atrogin-1的mRNA水平發現，饑餓組MuRF1的mRNA水平比對照組高14倍，比5dpf組高12.7倍；饑餓組Atrogin-1的mRNA水平比對照組增加195.6倍，比5dpf組增加9.7倍。這些數據表明，饑餓會誘發肌肉萎縮。
圖3
3. 細胞凋亡與饑餓誘導的肌肉萎縮無關
為進一步確定饑餓誘導的肌肉萎縮過程中是否會發生肌肉細胞凋亡，研究人員通過熒光跟蹤拍攝發現，在肌肉萎縮過程中，并未檢測到藍色凋亡細胞，也未觀察到肌肉組織中巨噬細胞的富集。
實驗數據表明，肌肉萎縮后肌肉細胞的細胞核數量保持不變（圖4E），這表明在饑餓誘導的肌肉萎縮過程中肌肉細胞沒有發生凋亡。此外，凋亡的肌肉細胞可能被巨噬細胞吞噬，定量結果顯示，在饑餓處理5天后，巨噬細胞數量沒有增加（圖4G），這表明在饑餓誘導的肌肉萎縮過程中沒有發生明顯的肌肉細胞死亡。
這些結果都表明，在饑餓誘導的肌肉萎縮過程中，肌肉質量損失是由于肌肉細胞的減小，而不是肌肉細胞凋亡。
圖4
4. 在饑餓誘導的肌肉萎縮中，肌肉細胞發生自噬
盡管沒有觀察到藍色的肌肉細胞凋亡，但研究人員注意到在饑餓處理3天后，肌肉細胞中開始出現大量的小囊泡，這些囊泡從4-5天起越來越大（圖4A）。
由于囊泡形成是自噬的標志之一，為了驗證在饑餓誘導的肌肉萎縮中肌肉細胞發生了自噬，研究人員通過高分辨率的單細胞成像觀察到，這些囊泡通常位于肌肉細胞邊緣（圖5A），可以幫助肌肉細胞在嚴重壓力下也能保持收縮力，且這些囊泡與溶酶體具有共定位，表明是自噬性囊泡。
蛋白印跡檢測顯示自噬標志物LC-II的水平隨著肌肉萎縮的進展逐漸升高；RNA測序分析顯示萎縮的肌肉組織中自噬相關通路和基因顯著上調，重新對肌肉萎縮的斑馬魚進行喂養后，自噬囊泡還會消失。
圖5
圖6
5. 自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮中，未觀察到肌肉細胞凋亡
此外，研究人員還建立了自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型。正常條件下飼養斑馬魚五年，長期跟蹤發現一些斑馬魚出現了肌肉萎縮。對出現肌肉萎縮表型的斑馬魚進行測量，結果顯示，這些肌肉萎縮的斑馬魚肌肉細胞平均直徑顯著減少了57%，肌肉萎縮的斑馬魚中MuRF1的mRNA水平比年輕斑馬魚增加了39.7倍，其Atrogin-1的mRNA水平增加了15.1倍。
為驗證肌肉萎縮的斑馬魚是否發生了肌肉細胞凋亡，研究人員通過熒光檢測發現，所有萎縮的肌肉中均沒有明顯的藍色凋亡肌肉細胞（圖7H）。TUNEL試驗也表明，自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮中，沒有發生細胞凋亡。轉錄分析顯示，具有肌肉萎縮表型的斑馬魚肌肉組織中，自噬相關的基因表達水平上調，而凋亡相關的基因則下調表達。
圖7
圖8
04、編者點評
本研究將一種基因編碼的蛋白熒光探針特異性地表達在斑馬魚的肌肉組織中，并構建了饑餓和自然衰老誘導的斑馬魚肌肉萎縮模型，揭示了肌肉細胞在饑餓和自然衰老引起的肌肉萎縮中并不會死亡而是通過自噬保持存活，重新定義肌肉萎縮的分子機制，強調自噬和蛋白質降解的核心地位，為肌肉萎縮治療提供了新靶點。
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