RNA干擾(RNAi)是一種在真核生物中高度保守的的轉錄后基因沉默機制，利用雙鏈RNA（dsRNA）高效、特異性降解細胞內同源mRNA從而阻斷靶基因表達。自發現以來，RNAi已迅速成為研究細胞和有機體水平上基因功能、調控和相互作用的強大工具。

1、RNAi的作用機制

外源dsRNA進入細胞后，在Dicer酶的作用下，首先被降解成21-25nt的siRNA。隨后siRNA中的反義鏈參與指導合成RNA誘導的沉默復合體（RISC），再由RISC介導切割目的mRNA分子中與siRNA反義鏈互補的區域，從而干擾靶基因表達的功能。

RNAi機制示意圖（Jain R G., et al. Insects, 2020.）

2、RNAi兩種常用技術手段

RNAi的應用可以通過兩種類型的分子介導：化學合成的雙鏈小干擾RNA (siRNA)或基于載體的短發夾RNA (shRNA)。

①siRNA是化學合成的小分子，導致基因沉默和序列特異性RNA降解的重要中間媒介，具有特殊的結構特征即5'端磷酸基團和3'端羥基，其兩條鏈的3'端各有兩個堿基的游離，通過與目標mRNA特異性互補結合降解mRNA。

②shRNA即小發卡或短發卡RNA，是一段具有緊密發卡環的RNA序列，可加工成siRNA，shRNA包括兩個短反向重復序列，可以克隆至shRNA表達載體，后通過質粒轉染或病毒轉導引入細胞，用于沉默靶基因的表達。

siRNA和shRNA結構

(A) siRNAs是短的RNA雙鏈，在3’端有兩個堿基的游離;（B）shRNA由正義鏈和反義鏈通過環狀序列隔開共同組成;（C）shRNA構建用于插入表達載體;

siRNA與shRNA兩者的共同點是都可以有效沉默或抑制目標基因的表達，但是相比化學合成的siRNA，基于載體的shRNA具有穩定性高、脫靶率低、作用時間長和易導入難轉染細胞等優勢，是研究者廣泛使用的技術。

siRNA和shRNA的異同點

一：多和1 shRNA載體構建

根據提供的高效siRNA靶點和靶基因信息構建多和1 shRNA質粒，將多條shRNA克隆至一個載體中，不僅可用于轉染細胞，也可包裝成病毒導入宿主。

優劣勢：

1) 將多個作用于同一基因不同mRNA部位的shRNA序列克隆進同一shRNA載體，大大增加目的基因下調表達的概率；

2) 將高效的、作用于多個靶基因的shRNA序列克隆進同一shRNA載體，實現多基因同時下調表達的目的；

3) 無需序列篩選，大大減少工作量；

4) 多種病毒載體相可供選擇，實現不同實驗目的。

不足之處：無法確定哪一條shRNA的干擾效果更好；

二：mir30-based shRNA質粒構建

與傳統shRNA只能在Pol III類型啟動子（U6或者H1啟動子）下表達不同，miR30-shRNA也可使用Pol II類型啟動子驅動表達，包括廣譜啟動子（如CMV、CAG和EF1a等）、Tet-On誘導調控啟動子TRE和組織特異性啟動子（如hSyn、TBG和cTnT等），可以啟動較大的基因轉錄，且需要polyA等轉錄終止信號。根據指定的啟動子和提供的shRNA序列將其構建至mir30-based shRNA質粒，實現組織特異性基因沉默。

三：誘導性shRNA質粒構建

包括Cre/loxp，Flp/Frt和Tet on等誘導系統。

以Cre on shRNA為例，該服務是使用FLEX(flip-excision)系統實現shRNA誘導表達。

FLEX是一種非常強大的控制基因表達的方法，它采用2對異質、反向的loxp位點(loxP和lox2272)，經過DNA翻轉產生帶有不同loxp位點的DNA翻轉，防止DNA的進一步翻轉，從而實現目標基因不可逆的翻轉。采用改良版FLEX，將2對異質、反向的loxp位點置于啟動子兩邊，通過Cre作用決定啟動子方向，通過不同熒光蛋白可視化shRNA的表達。