編者按
非甾體抗炎藥（NSAIDs），如阿司匹林、布洛芬、對乙酰氨基酚和舒林酸（sulindac）等，是全球最大類別的藥物之一，被廣泛應用于臨床抗炎、退燒和鎮痛治療。據報道，每天有超過 3000萬患者使用，但臨床應用后，NSAIDs的副作用不斷增加，且廣泛使用非甾體抗炎藥會增加孕婦和兒童急性非甾體抗炎藥暴露、攝入和毒性的風險。美國FDA統計數據顯示，大約1/3的藥物不良反應是由NSAIDs引起的，每年約有41,000名老年患者因NSAIDs住院治療，造成3300人死亡。因此，探索非甾體抗炎藥的不良反應機制，特別是在神經發育期間，將有助于指導臨床醫生更準確、更合理地選擇藥物。
2023年9月2日，華南理工大學醫學院張文清教授團隊與廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院副院長沈娟團隊合作，在Nature Communications（IF=16.6）上發表了最新研究，該研究對斑馬魚進行吖啶橙（AO）染色，評價了46種常用抗炎藥或抑制劑對其神經毒性的影響，發現過量使用舒林酸（sulindac）在幼年動物早期神經發育中選擇性誘導γ-氨基丁酸（GABA）能導致神經元凋亡，斑馬魚幼魚由于失去了抑制性神經而表現出過度活躍的行為，并使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和SR11237探索了細胞凋亡的潛在機制，為sulindac毒性的潛在機制研究提供了有價值的見解，并闡明非甾體抗炎藥在早期神經發育中的相關風險。
文章題目
Sulindac selectively induces autophagic apoptosis of GABAergic neurons and alters motor behavior in zebrafish
雜志：Nature Communications（IF=16.6）
發表時間：2023.9.2
作者：孫文威、王梅梅、張文清、黃志斌、沈娟等
單位：華南理工大學醫學院、廣東藥科大學生命科學與生物制藥學院
01、研究背景
非甾體抗炎藥（NSAIDs）是全球最大類別的藥物之一，廣泛應用于臨床抗炎、退燒和鎮痛治療。這類藥物通過抑制環氧合酶（COXs）的活性發揮其功效，影響花生四烯酸的代謝，從而導致體內前列腺素和其他促炎因素的減少，因其療效確切、價格低廉、使用方便，而廣受歡迎。
據報道，每天有超過3000萬患者使用，但臨床應用后，NSAIDs的副作用有所增加，且廣泛使用非甾體抗炎藥會增加孕婦和兒童急性非甾體抗炎藥暴露、攝入和毒性的風險。美國FDA統計數據顯示，大約1/3的藥物不良反應是由NSAIDs引起的，每年約有41,000名老年患者因NSAIDs住院治療，造成3300人死亡。然而，目前只進行了有限的研究來評估非甾體抗炎藥在神經系統中的毒性。因此，探索非甾體抗炎藥的不良反應機制，特別是在神經發育期間，將有助于指導臨床醫生更準確、更合理地選擇藥物。
斑馬魚模型是臨床評估NSAIDs神經毒性的良好選擇。在這項研究中，研究人員對斑馬魚進行吖啶橙（AO）染色，評價46種常用抗炎藥或抑制劑對其神經毒性的影響。研究者發現舒林酸（sulindac）選擇性地誘導斑馬魚和小鼠的γ-氨基丁酸（GABA）神經元凋亡。斑馬魚幼魚由于失去了這些抑制性神經而表現出過度活躍的行為。此外，研究者還使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和SR11237探索了細胞凋亡的潛在機制。研究結果表明，sulindac可能與RXRα結合，并引起自噬介導的GABAergic神經元凋亡。總之，這項研究的結果可為sulindac毒性的潛在機制提供有價值的見解，并闡明非甾體抗炎藥在早期神經發育中的相關風險。
02、研究結果
1、舒林酸（Sulindac）引發神經發育毒性
為了調查臨床治療中使用的抗炎藥可能產生的毒性作用，研究者進行了小規模的抗炎藥篩查，以檢查大腦發育毒性。受精后2天（dpf）的斑馬魚幼魚分于24孔板各孔中，每孔5尾，處理至4dpf，用AO染色進行篩選。受測藥物以10μM濃度溶解在DMSO和E3中，為了檢查這些藥物是否具有特定效果，研究者以不同濃度重新測試藥物并確認了斑馬魚的表型。結果發現，只有舒林酸（Sulindac）在斑馬魚幼魚的中腦中引起明顯的凋亡。相比之下，DMSO和其他藥物的毒性作用很少。有趣的是，這些凋亡細胞特異性地分布在中腦。
為了進一步確定中腦凋亡的細胞類型，使用神經元標記的轉基因斑馬魚Tg（Xla.Tubb：DsRedx）和血管標記的轉基因斑馬魚Tg（flk1：mCherry）來定位凋亡細胞。實驗結果表明，絕大多數凋亡細胞是神經元細胞，這表明舒林酸（Sulindac）對斑馬魚幼魚的早期神經發育產生了不利影響。
圖1
2、Sulindac選擇性地誘導了斑馬魚幼魚的GABA神經元的凋亡和運動行為的改變
為了進一步探索哪些類型的神經元受到蘇林達克的影響，使用了不同類型的斑馬魚神經元轉基因系。特別是，凋亡細胞與Tg（gad1b：mCherry）轉基因斑馬魚中的mCherry+GABAergic神經元共定位，但不與Tg（vglut2a：GFP）中的谷氨酸能神經元、Tg（islet：GFP）中的顱運動神經元或Tg（atoh7：mCherry）轉基因斑馬魚中的視網膜神經節細胞共定位。這些結果表明，sulindac有選擇地促進了GABAergic神經元的凋亡。有趣的是，已經證明GABAergic電路參與了行為運動。
為了進一步確認sulindac誘導的GABAergic神經元的凋亡是否影響了斑馬魚幼蟲的運動行為，使用了光周期刺激測試來監測5dpf幼魚的行為軌跡。幼魚運動軌跡及分析結果顯示，與對照組相比，暴露于蘇林達克的斑馬魚表現出多動行為，特別是在最高劑量組，這可能歸因于sulindac對GABAergic神經元的損害。
圖2
3、Sulindac通過斑馬魚的Akt途徑選擇性地誘導了GABAergic神經元的凋亡
為研究GABAergic神經元中sulindac選擇性的潛在機制，研究者結合RNA測序數據確定了一些與GABAergic神經元發育相關的基因，發現只有akt1時哺乳動物akt1的同源物，在3dpf斑馬魚幼魚的GABAergic神經元亞群中特異性表達。新的證據表明，akt1在哺乳動物大腦中高度表達，在大腦發育中起著至關重要的作用，因此，研究者假設akt1可能在sulindac誘導的GABAergic神經元細胞死亡中發揮重要作用。
為進一步證實這一假設，研究者在GABAergic神經元中對akt1進行了組織特異性敲除或akt1的過表達以觀察akt1對GABAergic神經元細胞死亡的凋亡調節。結合AO染色結果，證實這一假設，即：sulindac可以通過降低斑馬魚幼魚中腦的p-Akt水平來誘導GABAergic神經元細胞死亡。
圖3
4、Sulindac通過線粒體途徑誘導凋亡
為了進一步探索潛在的凋亡機制，將全頭組織分離以進行檢測。結果表明，與DMSO組相比，sulindac組在細胞質中的細胞色素c積累顯著增加。細胞色素c的釋放導致線粒體膜電位（ΔΨm）的損失，這是線粒體功能障礙的標志。
為了確認sulindac誘導的細胞凋亡是由線粒體途徑介導的，通過檢測熒光染料JC-1，用流式細胞儀分析ΔΨm的變化；設計特定的MO來抑制COXs的表達。結果表明，sunlindac導致線粒體功能障礙，并觸發了Bcl2依賴性線粒體凋亡途徑，而非COX依賴性途徑。
圖4
5、Sulindac通過PI3K/AKT/mTOR途徑促進RXRα依賴性自噬誘導的凋亡
凋亡過程通常伴隨著自噬的發生，自噬在凋亡過程中具有雙重作用。為研究sulindac對斑馬魚神經元凋亡和自噬的影響，注射紅色熒光蛋白（RFP）標記的Lc3質粒以標記自噬通量的大小，并使用AO染色來標記凋亡細胞。結果表明，在sulindac治療后，斑馬魚中腦的RFP-Lc3+和AO+細胞都急劇增加，且大多數RFP-Lc3+細胞都與AO+細胞共定位。
超微結構變化結果進一步揭示了sulindac在神經元中誘導自噬。然后，研究者通過結合sulindac和3-MA（自噬抑制劑）或Z-VAD-FMK（凋亡抑制劑）治療，探索了sulindac誘導的自噬和凋亡之間的關系，結果表明，sulindac誘導Bcl-2介導的自噬，從而促進神經元自噬細胞死亡。
研究者為確定sulindac激活自噬的途徑，使用SEA Search Server數據庫和SwissDock進行評估。結果表明sulindac可以與RXRα蛋白緊密結合。為了進一步確定sulindac和RCRα蛋白在腦組織中的相互作用以及sulindac是否被生物素化，使用了SR11237和western blot，結果進一步證實sulindac激活的自噬過程可能涉及與RXRα受體的結合。
另外，研究者還研究了自噬中的PI3K/AKT/mTOR通路，結果表明sulindac可能促進RXRα依賴性自噬，并通過抑制斑馬魚GABAergic神經元中的PI3K/AKT/mTOR信號通路誘導凋亡。
圖5
6、在小鼠中長期服用蘇林達克會導致新皮質GABAergic神經元多動和凋亡
根據在斑馬魚中的發現，研究者決定調查sulindac對哺乳動物行為調節和神經元凋亡的影響。胃內給藥一個月后，使用曠場實驗來評估小鼠的運動活動。結果發現，隨著小鼠sulindac劑量的增加，其異常多動性明顯增加，這與在斑馬魚中觀察到的現象相似。因此，這些結果表明，長期使用sulindac會導致脊椎動物多動癥。
為進一步證實小鼠GABAergic神經元的自噬細胞也是由sulindac誘導的，研究者進行H&E然和和Nissl染色，發現sulindac給藥1個月也導致小鼠在高劑量下神經元細胞顯著死亡。
此外，TUNEL結果與斑馬魚的觀察結果一致，小鼠GAD67陽性細胞的凋亡顯著增加。所有這些數據都表明，sulindac對GABAergic神經元有潛在的毒性作用，不僅存在于低等脊椎動物，也存在于哺乳動物。
圖6
03、編者點評
綜上，非甾體抗炎藥（NSAIDs）在臨床醫學中發揮著重要作用，主要用于臨床抗炎、退燒和鎮痛治療等，也是兒科最常用的藥物之一。本研究表明舒林酸（sulindac）選擇性地誘導斑馬魚和小鼠的γ-氨基丁酸（GABA）神經元凋亡，導致斑馬魚幼體和小鼠的行為活躍。此外，通過使用自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤（3-MA）和SR11237研究發現，sulindac可能與RXRα結合，并引起自噬介導的GABAergic神經元凋亡，為探索NSAIDs在早期神經系統發育過程中的作用開拓了新的視角，也為了解NSAIDs類藥物毒性機制研究及治療提供了重要線索。
作為健康美麗產業CRO服務開拓者與引領者、斑馬魚生物技術的全球領導者，環特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動物、人體”四位一體的綜合技術服務體系，開展健康美麗CRO服務、科研服務、智慧實驗室搭建三大業務。目前，環特已建立200多種斑馬魚模型及腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養平臺，歡迎有需要的讀者垂詢！