酶聯免疫吸附試驗，也稱為ELISA，是酶免疫分析技術中應用最廣泛的技術。1971年，Engvall等人發表了一篇利用ELISA定量測定IgG的文章，將1966年用于抗原定位的酶標抗體技術發展成為一種定量液體樣品中微量物質的方法。

ELISA原理

ELISA的原理包括利用抗原和抗體之間的特異性結合，將抗原或抗體固定在固相載體上。在檢測過程中，未結合的物質通常通過洗滌板來去除，酶促反應后底物的顏色用于樣品中蛋白質的定性和定量分析。

ELISA中常用的主要試劑

1.抗體: 單克隆抗體特異性強，多克隆抗體結合親和力高。高端檢測試劑盒需要高效配對。

2.抗原: 主要是重組蛋白、細胞因子和測試樣本。有效的標準物質需要美國尼伯斯克/世衛組織校準。

3.顯色系統: 最初，辣根過氧化物酶(HRP)與TMB和OPD等常見底物形成顯色系統。此外，堿性磷酸酶(AP)利用對硝基苯磷酸作為底物產生黃色。葡萄糖氧化酶(GOD)通過葡萄糖氧化酶法產生特定的顏色。最后，β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)利用4-methylumbelliferyl-β-D-galactopyranoside (4MUG)作為底物產生高強度熒光。

 Figure 1: Schematic Diagram of Common Reagents Used in ELISA

ELISA種類

根據試劑的來源、樣品的性質和分析的具體條件，可以設計各種類型的檢測方法。根據原理和操作，市場上最常用的方法有:

1. 間接ELISA

這種方法最常用于抗體檢測。其原理包括使用酶標記的第二抗體來檢測與固相結合的第一抗體，然后進行比色檢測。其優點是被檢測的第一抗體不需要被標記，使得該過程快速和方便。直接ELISA類似于間接ELISA，但是第一抗體用酶標記。檢測孵育也主要涉及抗原。然而，與間接ELISA相比，直接ELISA的靈敏度有限，需要謹慎使用。

Figure 2: Schematic Diagram of Indirect ELISA

2. 三明治夾心ELISA

它進一步分為雙抗原夾心ELISA和雙抗體夾心ELISA，其用于檢測抗體或抗原水平的原理相似。以雙抗體夾心ELISA為例，將捕獲的抗體包被在固相載體上，加入抗原或檢測樣品進行結合。隨后，加入與抗原結合的檢測抗體，形成夾心結構。雙抗體夾心ELISA是市場上最常用和最方便的分析方法。

Figure3：Double Antibody Sandwich ELISA Diagram

3. 競爭性ELISA

競爭ELISA通常用于檢測小分子抗原和半抗原。樣品中存在的抗原越多，結合的酶標記抗原越少，導致競爭性負相關系統。這樣一來，比色物質就會少一些。樣本中的抗原含量可以基于比色物質的比率來擬合。

Figure 4：Competitive ELISA Schematic

4. 其他方法

a.免疫抑制ELISA: ELISA中測試樣品對底物顯色的抑制程度與樣品中所含抗原的量成正比。兩者的區別在于待測抗原的量，類似于競爭性ELISA。

b.阻斷ELISA: 也稱為競爭性ELISA，這種方法用于檢測特異性抗體。其原理包括將抗原包被在固相上，然后在測試樣品和酶標記的第一抗體之間進行競爭孵育。測試樣品中存在的抗體越多，顯色越淺，反之亦然。該方法涉及非洲豬瘟病毒抗體檢測試劑盒。

c.此外，還有其他ELISA變體，包括用于檢測IgM抗體的抗體捕獲ELISA、Dot-ELISA(使用硝酸纖維素膜)和C-ELISA(使用聚酯織物),它們涉及固相載體的修飾，以及技術分類，例如TRFIA和多重檢測方法。

ELISA試劑盒評估

ELISA試劑盒的質量由多個指標決定。優秀的試劑盒需要評估以下六個主要標準，分析如下:

1. 準確性

a.回收率:校準試劑盒的數據準確性。異常高或異常低的速率可能導致樣品分析不準確。

b.線性:試劑盒稀釋液和樣品微環境的準確性。與預期值的偏差可能表明不準確。

2. 精密度

a.分析內精密度:在單個實驗中，評估相同已知濃度的重復孔之間的差異。

b.測定間精密度:評估同一樣本的多個實驗之間的差異。

3. 靈敏度

檢測下限:顯著區分空白信號的最小信號值，表示試劑盒的靈敏度。較低的值表示較高的靈敏度。

4. 特異性

a.交叉反應:通過測量不同分子與試劑盒抗體的結合能力來評估特異性。交叉反應性越高，特異性越差。

b.抗干擾能力:評估同源物質和內源性物質對檢測系統的干擾。

5. 天然樣品檢測

天然樣品和適當樣品類型的檢測分析。確定樣本類型以避免假陽性或假陰性結果。

6. 穩定性

試劑盒的保質期和穩定性對于確保準確檢測至關重要。更高的穩定性允許試劑盒更長的儲存時間。

Figure 5: Classification of ELISA assay kit products

ELISA應用

ELISA技術是定量特定靶蛋白的金標準，可提供快速、穩定且易于分析的結果。它可以應用于生物分子/小分子的定量分析、親和力的評估或篩選以及重組蛋白或細胞因子活性的比較分析。它通常用于檢測細胞因子、趨化因子、生長因子和其他靶標，也應用于癌癥、干細胞、免疫學、神經學和信號轉導等研究領域的靶標。

Figure 6: Technical applications of ELISA

在生物醫學研究、細菌疾病和臨床診斷中，ELISA作為一種成熟的免疫學檢測方法，用于定量測量所需物質，如細胞因子和抗原。它的應用非常廣泛。了解ELISA并選擇合適的檢測試劑盒可以極大地簡化研究工作并獲得顯著的結果。

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