編者按
I型CRISPR-Cas系統廣泛存在，在原核生物基因組編輯和基因調控方面表現出高通用性和高效率。然而，由于其多亞基組成和大尺寸，其在真核生物中的應用尚未得到深入的研究。
2024年8月23日，中國科學院微生物研究所向華團隊在國際期刊《自然·通訊》（Nature Communications）上發表了題為《工程化最小I型 CRISPR-Cas 實現人類細胞的轉錄激活和堿基編輯》的最新研究成果，成功應用Class 1中最精簡的I-F2型系統在人類細胞中實現了高效基因調控，并創新性地開發了具有寬編輯窗口的堿基編輯工具。
該研究證明了I型-F2級聯，I型系統中最緊湊的，總基因大小小于SpCas9，可以被開發用于人類細胞的轉錄激活。工程I-F2工具的效率可以匹配或超過dCas9。此外，使用I-F2級聯創建了一個堿基編輯器，引入了一個相當寬的雙峰分布的編輯窗口(~30 nt)。它可以擴展目標位點，這對破壞功能序列和基因篩選是有用的。
文章題目
Engineered minimal type I CRISPR-Cas system for transcriptional activation and base editing in human cells
雜志：Nature Communications（IF=16.6）
發表時間：2024年8月23日
作者：郭京、龔路遙、禹海英、向華等
單位：中國科學院微生物研究所等
01、研究背景
CRISPR-Cas系統是一種廣泛分布于原核生物中的適應性免疫系統，可分為兩類、六種類型和30多個亞型。第1類包括I型、III型和IV型，其效應模塊由多種蛋白質組成；第2類包括II型、V型和VI型，其特征是單一的多結構域效應蛋白。CRISPR免疫機制通常涉及適應、crRNA生物發生和干擾三個過程。
I型系統是最常見的CRISPR-Cas類型，分為I-A到I-G等7個亞型。I型的crRNA結合復合物被稱為Cascade（用于抗病毒防御的CRISPR相關復合物），它與crRNA相結合進行靶標識別，促進crRNA及其互補的靶DNA的雙重形成以構建R環，并招募Cas3核酸酶從而過程性降解DNA。I型系統已被開發成各種微生物基因組操作工具，如具有同源修復模板的基因組編輯工具、轉錄調控工具、大片段刪除工具、不需要同源重組的大片段整合工具，及使用Cascade-Cas3進行基因組編輯和基因調控的工具。
自2019年以來，多個I型亞型已成功用于真核生物基因組操作。當Cascade和Cas3同時表達時，Cas3表現出外切酶活性，導致多達200kb的大片段缺失。I-D型也報告了類似的活性，其中Cas10是一種功能性核酸酶，同時檢測到了短核苷酸。Cas3 與胞苷脫氨酶 (CDA) 的融合可以實現廣泛的隨機誘變，覆蓋范圍多達55kb，這為優化復雜的生物合成途徑提供了有效的工具。
此外，Cascade可以與不同的域融合以實現不同的功能。當Cascade與依賴于二聚化的非特異性FokI核酸酶域結構域融合時，其編輯效率與dCas9-FokI相當；當Cascade與轉錄激活或抑制域融合時，可以調節目標內源基因的表達水平。
然而，真核生物中的Cascades由包括Cas6的4-5個亞基組成，Cas6將crRNA前體（pre-crRNA）加工成成熟的crRNA。如，大腸桿菌（Escherichia coli）K12型I-E級聯系統的Cascade由5個亞基組成，總基因大小約為4.4 kb。乳糖奈瑟球菌ATCC 23970型I-C級聯系統的Cascade由4個亞基組成，總基因大小為約3.8 kb，包括隱藏的小亞基在內。大基因尺寸阻礙了在載荷尺寸受限的應用中的應用，例如廣泛應用的腺相關病毒（AAV）載體，其包裝限值約為4.7 kb，這阻礙了大多數CRISPR工具的臨床應用。因此，挖掘更緊湊的I型系統將有助于將I型基因組操作工具應用于真核生物。
另一方面，R環的形成是CRISPR系統的一個重要特征。在R環結構中，被crRNA間隔器移位的非靶標DNA鏈被暴露并可供其他分子訪問，這被堿基編輯技術所利用。通過將單鏈DNA（ssDNA）脫氨酶或糖基化酶融合，并與催化能力受損的Cas核酸酶再融合，堿基編輯器可以在不需要雙鏈DNA（dsDNA）斷裂或供體DNA模板的情況下進行各種堿基轉換。然而，堿基編輯器主要是在催化能力受損的Cas9或Cas12的基礎上開發的。
值得注意的是，與Cas9或Cas12相比，I型系統形成的R環要寬得多，跨度約為30-40個核苷酸，而Cas9或Cas12的R環要窄得多，約為20個核苷酸。I型系統中的這種擴展的R環可能為ssDNA脫氨酶或糖基化酶提供更多的核苷酸底物，從而擴展靶向位點。因此，探索I型系統在堿基編輯中的潛力，對于開發具有廣泛編輯窗口的堿基編輯器可能是有價值的。
在這項研究中，研究人員探究了緊湊型I-F2系統在人體細胞中的應用。I-F2型系統具有迄今為止已識別的最緊湊級聯，其由Cas5、Cas6和Cas7組成，沒有大亞基(Cas8)或小亞基(Cas11)，其總基因大小顯著小于SpCas9，使其成為更易于在真核生物中傳遞的候選基因。然而，之前將該系統應用于真核生物的嘗試均未成功。
在這里，研究人員提出了一個緊湊的I-F2型系統來操縱人類基因組。該級聯源自Mos350，總基因大小約2.7 kb，優選簡單的5'-CC原間隔區相鄰基序（PAM）。通過將轉錄激活域與Cascade融合，可以調節人類細胞中的基因表達，并通過crRNA和Cascade工程實現強大的活性。此外，通過將脫氧腺苷脫氨酶與級聯酶融合，研究人員開發了一種具有I-F2系統的基礎編輯器。有趣的是，這種腺嘌呤基編輯器（ABE）引入了一個寬的編輯窗口（~30 nt），具有雙峰分布，并且可以實現超過50%的編輯效率。具有寬編輯窗口的I-F2 ABE可用于基因篩選和干擾功能序列，這些結果突出了緊湊型I-F2系統在真核生物中的潛力，并擴展了基礎編輯工具箱。
圖1 Class 1最精簡I-F2型CRISPR-Cas系統
02、研究成果
1、首次獲得在真核細胞中有活性的精簡I-F2型系統并成功構建CRISPRa工具
通過生物信息學分析，向華團隊在數據庫中找到93個不同菌種來源的I-F2型CRISPR-Cas系統。這極大地擴充了這類系統的基因資源，為其應用提供更多選擇。其中11個不同來源的I-F2型CRISPR-Cas系統被合成并在人類細胞中測試其功能。最終，他們發現來自奧斯陸莫拉氏菌(Moraxella osloensis CCUG 350，Mos350)的I-F2型系統在真核細胞中可以表現出較好的活性。通過在該系統的Cas7蛋白上融合VPR轉錄激活因子，可實現多個基因的表達上調。
圖2. 基于精簡的I-F2型系統開發CRISPRa工具
2、通過crRNA和蛋白工程化改造，實現了I-F2 CRISPRa工具更高效的轉錄激活
在I型CRISPR-Cas系統中，通常crRNA的間隔序列(spacer)長度每增加6 nt，就會有一個額外的Cas7亞基參與Cascade復合物的組成。因此，該團隊通過延長spacer來增加Cascade中Cas7-VPR融合蛋白的拷貝數，結果檢測到了更高的基因轉錄水平。
接著，通過分析Cascade-crRNA-DNA三元復合物的結構信息，將Mos350 Cas7蛋白中第175位亮氨酸(L)替換成含有芳香殘基的苯丙氨酸(F)來增強Cas7與核酸之間的堆積作用力，結果提升了靶標DNA-crRNA雜交雙鏈的穩定性，進一步提高了轉錄激活效果。工程化改造后的I-F2 CRISPRa工具可以與dCas9-VPR工具效果相當，在個別靶點效果甚至更好且脫靶效應更低。
圖3. 通過crRNA和蛋白工程化改造提升I-F2 CRISPRa激活水平
3、在I型Cascade中融合腺嘌呤脫氨酶TadA-8e，獲得了具有獨特寬編輯窗口的I-F2 ABE堿基編輯工具
傳統的堿基編輯工具利用催化活性受損的Cas9或Cas12融合脫氨酶。Cas9或Cas12形成的R-loop約20 nt，最終得到較小的編輯窗口(通常小于10 nt)，限制了堿基編輯工具的應用范圍。I型系統可以形成比Cas9或Cas12寬許多的R-loop(約30 nt)，推測其可能形成獨特的編輯窗口。
實驗結果表明，I-F2 ABE能形成約30 nt的寬編輯窗口，且呈現雙峰特征，在第9位和第27位堿基附近編輯效率達到峰值。該工具在基因組中具有普遍的堿基編輯活性，編輯效率可超過50%，并且在疾病治療相關位點也表現出了應用潛力。
圖4. I-F2 ABE堿基編輯工具具有獨特寬編輯窗口
研究表明，通過融合不同的結構域，I-F2型Mos350 Cascade可以在人類細胞中實現高效的轉錄激活或寬窗口的堿基編輯。Mos350 Cascade基因之和約2.7 kb，遠小于SpCas9(約4.1kb)，僅由3種亞基(Cas5、Cas6和Cas7)組成?；谠撓到y開發的工具有望實現單個AAV遞送。其中Cas6可以加工前體crRNA，易于實現多位點的同時靶向。
在轉錄調控方面，基于I型系統的強可塑性，可以通過改變spacer長度實現不同轉錄水平的精細調控。在堿基編輯方面，I-F2 ABE能產生獨特的寬編輯窗口，因此具有更多的可靶向位點，并能誘導更多的突變類型。寬編輯窗口適用于破壞功能序列，如破壞感染相關基因或抑制基因用于遺傳病治療。
此外，寬編輯窗口還適用于作物育種中重要基因的原位飽和誘變與多重堿基編輯。這項研究突出了精簡的I型系統在真核生物中的應用潛力，尤其是具有寬編輯窗口的堿基編輯工具。而I型系統的多亞基結構，還有望為開發更多新穎性的基因操作工具提供底層平臺。
圖5. I-F2型系統可提供多樣性基因操作工具底層平臺
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