傳統的體內血管生成實驗方法包括角膜微囊袋實驗、腸系膜實驗、海綿/基質植入、圓盤分析（DAS）、斑馬魚等。然而，這些實驗不僅技術要求高、成本昂貴、耗時，還涉及倫理問題。與體內血管生成實驗相比，在體外通過特定基質維持細胞生成的血管是一種更經濟、更實用的實驗方法。其中，最常用的支持細胞生長的基質是從EHS小鼠腫瘤中提取的基質膠，即Arcegel Matrix Gel。

Arcegel Matrix Gel的主要成分包括層粘連蛋白、IV型膠原、肝素硫酸蛋白多糖（HSPG）、纖維連接蛋白，以及TGF-beta、EGF、IGF、FGF、組織型纖溶酶原激活劑等生長因子，這些生長因子是EHS腫瘤固有的。它為組織和細胞提供支持、拉伸強度和支架支持，作為細胞粘附和移動的三維亞結構，并作為生長因子、趨化因子和細胞因子的儲存庫。此外，它還作為細胞形態和分化的信號分子。由Arcegen Biotechnology開發和生產的Arcegel Matrix Gel不含LDEV（乳酸脫氫酶升高病毒），內毒素含量極低，并且已經過支原體檢測以確保無污染，包括不同類型如基礎濃度、高濃度、低生長因子等的基質膠。
 

應用指南

產品特點

高安全性：無LDEV（乳酸脫氫酶升高病毒）

多種濃度：濃度范圍從8到20毫克/毫升

出色的批間穩定性：嚴格的生產質量檢驗流程確保不同批次之間的性能穩定

低內毒素：內毒素含量 ≤ 4 EU/毫升

污染物檢測：經檢測無支原體、細菌和真菌殘留

高批次產量：批次產量高于L級水平

良好的兼容性：與任何類型的細胞培養基兼容
 

血管生成實驗

基質膠的制備

1. 在實驗前一天，從冰箱中取出Arcegel基質膠，并在4°C的冰箱中解凍過夜，同時預冷將要使用的耗材。

2. 在實驗前，將Arcegel基質膠始終保持在冰盒中。

3. 打開血管生成載體載玻片的包裝，取出載玻片。

4. 向每個孔中加入10 μl的Arcegel基質膠，確保膠體垂直添加在內孔上方，以防止殘留膠體流過上孔。

凝膠化

1. 用蓋子蓋住載體載玻片，準備一個10 cm的培養皿，并在內部放置一塊濕紙巾，以創建濕潤的環境。

2. 將載體載玻片放入培養皿中，并用培養皿的蓋子蓋住。

3. 將整個培養皿放入CO2培養箱中，靜置約30分鐘以進行凝膠化，同時準備細胞懸浮液。

 細胞接種

1. 將消化后的細胞制備成濃度為2×10^5細胞/ml的懸浮液，并充分混合。

2. 取出已固化的載體載玻片。

3. 向每個孔中加入50 μl的細胞懸浮液，確保移液槍頭垂直于上孔，不接觸下孔中的膠體。

4. 添加細胞培養基，蓋上蓋子，靜置一段時間后，所有細胞將沉降并附著在基質膠的表面。
 

圖像采集
根據細胞生長速率定期觀察并拍照，保留圖像。

免疫熒光染色（可選）

1. 小心地從孔中移除培養基，不要觸碰凝膠或細胞網絡。將鈣黃綠AM在無血清培養基中稀釋至最終濃度為6~8 µg/ml。

2. 將細胞染色溶液加入以完全浸沒細胞，并在室溫下避光孵育30~40分鐘。

3. 用PBS洗三次，緩慢地向上方孔中加入PBS以避免細胞脫落。

4. 使用激發波長Ex=485 nm和發射波長Em=529 nm進行熒光觀察。
 

結果分析

測量并記錄管狀長度、覆蓋面積、環數和節點數，并進行統計分析。

圖：血管生成結果

圖：血管的免疫熒光染色

常見問題解答

1. 收到的基質凝膠顏色變化（從淺黃到深紅）的原因是什么？
對于含有酚紅的基質凝膠，顏色變化的主要原因是酚紅與碳酸氫鹽和二氧化碳之間的相互作用，但當與5%的二氧化碳達到平衡時，顏色差異會減小。解凍后，輕輕搖晃試劑瓶，使基質凝膠均勻分散。

2. 處理基質凝膠時應采取哪些預防措施？
所有操作都應在無菌條件下進行，并使用預冷的移液槍頭，以確?；|凝膠均勻分散。

3. 基質凝膠應如何分裝、冷凍和使用？
解凍后，Arcegel基質凝膠可以分裝到多個預冷的小冷凍管中。所有分裝都應使用預冷的冷凍管，快速冷凍，并儲存以避免反復凍融。使用過程中涉及的所有物品都應預冷，包括處理基質凝膠時使用的預冷移液槍頭、槍頭和管子。
 

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