血管生成，是指從已有的毛細血管或毛細血管后靜脈發展形成新的血管，血管生成在腫瘤侵襲、傷口愈合、組織再生等多個領域都具有重要的研究價值，已經成為當前科研的熱點之一。本文將從實驗原理、操作細節到定量分析，幫你輕松搞定血管生成實驗全流程！

一 實驗原理是什么？

內皮細胞（如人臍靜脈內皮細胞HUVEC）在特定基質膠上受生長因子（如VEGF）刺激后，通過遷移、增殖和連接形成管狀網絡結構，這一過程可直觀反映血管生成的動態變化，常用于藥物篩選或信號通路研究。

二 實驗步驟有哪些？

1.材料準備

細胞選擇：推薦原代HUVEC（傳代2-8代內效果最佳）。

基質膠：使用Arcegel Matrix High Concentration, LDEV-Free基質膠，需提前24小時于4℃解凍，操作時全程冰上預冷耗材。

培養基：含5-10% FBS的內皮細胞專用培養基，添加VEGF、肝素等生長因子。

2. 基質膠鋪板

基質膠稀釋：將基質膠與預冷培養基按一定比例混合（可通過預實驗確定，在1：1附近嘗試），輕柔混勻避免出現氣泡（基質膠濃度最好≥10 mg/mL，低濃度易導致成膠失?。?/span>

鋪膠技巧：將混合液垂直滴入預冷孔板（96孔板50 μL/孔，24孔板100-200 μL/孔），4℃靜置10分鐘使膠均勻分布，37℃孵育30分鐘固化。

判斷加膠量：通過觀察載玻片下孔覆蓋的格子紙變形情況（格子無變形為最佳）。

3. 細胞接種與觀察

細胞處理：對數生長期的細胞經無血清饑餓處理16-24小時，消化后重懸至2×10? cells/mL。

接種操作：每孔加入50 μL細胞懸液（約10,000個細胞），避免槍頭觸碰下孔膠體。若液體不足，補充無細胞培養基至滿孔。靜置10-15分鐘，使細胞自然沉降至基質膠表面。

培養條件：37℃、5% CO₂培養箱中孵育，4-12小時內觀察管狀結構形成（原代細胞需更長時間）。

4.圖像采集

按照細胞生長速度定時觀察拍照、留存圖像?？稍?小時、12小時、24小時分別采集圖像。

也可在熒光染色后對其進行熒光觀察。

血管生成結果圖

血管熒光染色圖

附熒光染色步驟：移除培養基后，加入50 μL Calcein AM（96孔板，終濃度6-8 µg/mL，其他孔板依面積折算），避光孵育30分鐘，PBS清洗3次后熒光成像（Ex/Em: 485/529 nm）。

三 數據分析從哪下手？

在血管生成實驗中，通常通過以下參數對結果進行分析：

血管長度：總分支長度。

成環數：閉合的血管環數量。

節點數：血管交叉點數量。

覆蓋面積：細胞網絡占據的區域比例。

對以上數據進行測量和記錄，并進行統計分析。

分析工具：推薦使用ImageJ或MetaMorph等軟件進行自動化分析。

注意事項要牢記

預實驗優化：不同細胞類型需調整密度，建議預實驗確定最佳條件。

避免氣泡：槍頭預冷、垂直緩慢加樣，若出現氣泡可嘗試4℃離心去除（300×g，10min）。

細胞活力：接種前確保細胞活率＞95%，傳代次數過高的細胞成管能力顯著下降。

時間控制：細胞通常在6-16 h內形成較成熟的管狀結構，24 h后，細胞逐漸凋亡，小管結構破裂并與基質分離。細胞狀態較差時，可能18-24h成管。建議第一次實驗時，每4個小時觀察一次。

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