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（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
注：本期分享來源于文獻，如有錯誤及不足之處，歡迎各位老師批評指正。
[1]Ocana-Santero G , Javier Díaz-Nido, Saúl Herranz-Martín. Future Prospects of Gene Therapy for Friedreich's Ataxia[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2021, 22(4):1815.
[2]ZMD Jingdong, XMD Huangui. Brain Stereotaxic Injection[J]. Springer New York, 2014.
[3]Cristina, D, Peterson, et al. AAV-Mediated Gene Delivery to the Spinal Cord by Intrathecal Injection.[J]. Methods in Molecular Biology, 2019.
[4]Gessler D J , Tai P , Jia L , et al. Intravenous Infusion of AAV for Widespread Gene Delivery to the Nervous System[M]. 2019
前期，我們給大家分享了在神經系統研究中AAV血清型和啟動子的選擇『是干貨??！神經研究中啟動子和血清型這樣選！』，本期我們與各位老師繼續分享關于AAV注射方式的有關內容。目前AAV在神經系統研究中的注射方法主要有以下幾種：腦實質內注射、靜脈注射、腦室注射（ICV）、枕大池內注射（ICM）和鞘內注射（IT），其中ICV、ICM和IT注射是通過腦脊髓液進行傳遞。每種注射方式各有優缺點，研究者可根據具體的研究對象以及實驗方案，選擇適合的注射方式，推薦進行預實驗對實驗效果做初步測試，以得到更優的選擇方案。
表1.四種常用AAV神經給藥特點
（Ocana-Santero G et al. ，International Journal of Molecular Sciences, 2021）
腦立體定位注射，相比其他注射方式靶向性強，注射病毒體積小，但是侵入性也強，且對操作者具有很高的要求。在立體定位手術時，顱骨上常用的注射參照點是前囪，也就是中矢狀冠狀縫的交叉點（下圖B中的十字交叉點）。具體操作步驟如下：
1. 實驗動物稱重，進行麻醉；
2. 待實驗動物完全麻醉后，用剃毛器將動物頭頂眼睛至耳朵之間的毛發剃除干凈；
3. 將麻醉后的實驗動物固定于腦立體定位儀上；
具體操作為：實驗動物眼部涂抹青霉素眼藥膏以保護其雙眼；將門齒掛在門齒掛鉤上，確保頭部保持固定；檢查左右耳桿是否在同一水平上，將左右耳桿通過外耳道插入實驗動物耳內。實驗動物固定好的標準為：鼻對正中，頭部不動，提尾不掉，目測大腦放置水平；
4. 手術：用碘伏/ 無色葡萄糖氯己定溶液對實驗動物頭皮進行消毒清理，用手術刀沿中間位置剪開頭皮，用鑷子對表面的結締組織進行清理，暴露實驗動物的顱骨表面；然后進行調平，首先找到前囟這個坐標，并將其歸零，然后向左右調平，使左右兩側處于同一水平，調整前后囟，使前后囟也在同一水平；
5. 病毒注射：通過查詢實驗動物的腦立體定位圖譜確定待注射腦區的位置（下方圖片是大鼠和小鼠的腦譜），并確定其坐標值，即ML 值（X 軸）、AP 值（Y 軸）、DV 值（Z 軸）；根據目標腦區設定好坐標，移開注射針，用顱骨鉆開窗( 由于顱骨薄, 故務必注意顱骨鉆的力度??！), 操作時避免傷及腦組織；微量注射器吸取病毒液，隨后固定在定位儀上，根據設好的坐標進行病毒注射，注射速度控制在0.1-0.15μL/min，注射劑量視具體實驗而定。注射完畢，留針10min，以便病毒液充分吸收，然后慢慢回針；
6. 縫合頭皮并消毒, 完成腦定位注射; 將動物從腦立體定位儀取下, 回籠待蘇醒; 動物蘇醒后,正常喂養, 病毒注射后2-4 周可檢測轉基因的表達。
提示：若手術麻醉時間較長，建議不要用酒精消毒，防止酒精揮發導致動物體溫過低而死亡。手術過程和蘇醒過程注意保暖。
圖1. 腦立體定位注射示意圖
（Van der Perren A et al. JOVE-J VIS EXP. 2016）
與系統注射和實質內注射相比，鞘內給藥是一種具有較低劑量要求的微創替代方法。步驟如下：
1、使用毛巾覆蓋在小鼠頭部和背部，露出髂嵴以下的腰部區域；用非慣用手的拇指和食指抓住鼠的髂骨(髖骨)，手的頂部輕輕放在小鼠身體和頭部上，使其保持平靜。
注：在髂骨上的握力應該足夠強，以固定小鼠的腿部活動，并使腿部向外和向下伸展。
2、使用慣用手食指從腰椎到骶部沿脊柱輕輕按壓，同時使用非慣用手輕輕上拉小鼠，以打開椎節之間的空間，方便進針。
3、將1 ?”號針的斜面指向小鼠頭部，然后將針以70°角插入脊柱中線的腰椎處，當感覺針碰到骨頭時，將針的角度調整到30°夾角，并將針插入椎節之間。
注：需多次嘗試找到合適的進入點，針頭進入脊柱后推針沒有阻力，尾巴或后腿的反射性彈跳出現時，說明已正確入針。
4、輕輕壓下注射器的活塞，將5-10μL的AAV病毒懸液注射至蛛網膜下腔。
注：注射時間控制在10-30s較好，速度太快會導致小鼠后腿抽筋，該現象會在60s內消失。
5、注射后，將針180°旋轉1-2次，然后將針從脊柱中取出。
6、小鼠放回籠子觀察，確認恢復正常運動功能。
注：此法適用于成年小鼠或大鼠。
系統性給藥方式，侵入性較小，但是相比其他注射方式特異性也較差，因此所需病毒體積更大。步驟如下：
1、調整光源位置以便照亮顯微鏡區域，中等強度的光照為佳。
2、將一個新生幼鼠直接置于冰上1-3min，進行麻醉。
3、當動物在冰上麻醉時，在注射器中注滿AAV病毒，注射體積不應超過100μL。
4、在顯微鏡下觀察幼鼠。用不持注射器的手的食指放在幼鼠口鼻處，中指放在耳芽處，以便拉伸幼鼠的皮膚，可見顳淺靜脈。
5、確定顳淺靜脈。可通過皮膚看到位于耳芽前部，周圍毛細血管下部，有一條隱約可見的靜脈血管，從背部到腹部，匯入頸靜脈，這就是顳淺靜脈。
6、注射器針尖斜面插入顳靜脈。可以看到針尖斜面通過皮膚的以后被血填充。輕壓注射器，并注意幼鼠臉側面的靜脈變白。
1、注射異氟醚對小鼠進行麻醉，使用非慣用手手掌握住小鼠背部，將拇指放在氣管正側面，頭部皮毛攏至手掌，使小鼠眼球凸起。
2、將手腕支撐在穩定的表面上，用拇指、中指和無名指握住注射器，將食指放在柱塞上方。
3、對小鼠施加輕微壓力使眼睛凸出，針頭對準內眥，斜面朝外，將針頭以45°插入眶后竇中心約5mm；
4、使用0.5ml 28G注射器緩慢注入150-200μL病毒懸液；
5、緩慢地取出針頭，確保針頭不會劃傷眼角膜。使用無菌紗布止血，并在眼睛上涂抹藥膏助其恢復。
6、注射后，將小鼠放回籠中恢復直至清醒。
（Gessler D J et al. Methods Mol Biol. 2019 ）
1、將小鼠放入約束器中，使尾巴從開口處露出。避免過度限制小鼠，以免導致其呼吸受阻。
2、在尾部涂抹70%異丙醇。
3、將小鼠尾巴拉直，可看到尾巴兩側各有一條側脈。
4、將針尖以30°角插入側靜脈中。一旦針尖穿過了靜脈的一半，重新調整針頭，使其與靜脈的長度一致(圖3c)。如果針頭插入正確，則按壓注射器注射時應無阻力。
5、使用0.5ml 28G注射器緩慢注射300μLAAV病毒懸液，此時靜脈顏色會變白，大約4s后，顏色恢復正常。
6、小心將針頭取出，用吸水紗布按壓注射部位10秒進行止血。
7、將小鼠放回籠子。
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