類器官是指利用干細胞、祖細胞、腫瘤細胞等在體外培養的三維細胞結構，它們展現出空間結構和類似組織的排列。2021年，類器官技術被中國“十四五”規劃確定為重點研發方向之一。作為疾病模型，與傳統的二維疾病模型相比，類器官更接近體內環境，因此在細胞治療、藥物開發、遺傳工程、免疫學和組織再生等領域至關重要。

以下內容將指導您完成培養小鼠腸道類器官的整個過程，并強調相關注意事項，以盡量減少培養過程中的陷阱。

實驗材料

小腸類器官培養方法

1、樣本準備

通過頸椎脫位的方式對小鼠實施安樂死，并用酒精對表面進行消毒。

在無菌條件下，從距離胃部3到15厘米的小腸中提取腸道組織，使用鑷子仔細去除腸系膜和脂肪，將其放入含有1%抗生素/抗真菌劑的DPBS溶液中，并置于4°C下保存。

2、樣本清洗

使用注射器將腸道沖洗2-3次，然后仔細用手術剪刀剪開腸管，將腔面朝上放置。

使用手術刀片輕輕刮除腔面上的絨毛，直到組織變得透明。在含有DPBS的新培養皿中清洗腸道組織2-3次。

3、樣本初步處理

將清洗干凈的小腸組織切成2毫米寬的小塊，并轉移到一個新的50毫升離心管中。

用DPBS輕輕沖洗組織3-5次，以去除絨毛細胞和浮動的脂肪組織。

4、組織消化

向清洗干凈的小腸組織塊中加入10-15mL預冷的含有3-5mM EDTA的DPBS溶液，并在4°C下消化約30分鐘，每10分鐘輕輕搖動試管。

消化后，倒掉EDTA溶液，并用新鮮的DPBS輕輕沖洗組織2-3次，以去除殘留的EDTA。

向小腸組織塊中加入10-15mL預冷的含有0.1% BSA的DPBS溶液，反復用移液管抽吸和懸浮組織碎片，以分離隱窩細胞。

當觀察到大量類似隱窩的結構時停止抽吸，然后通過70μm濾網過濾組織懸液，并收集通過濾網的組織懸液。

5、混合物制備

將隱窩沉淀重新懸浮在Arcegel基質凝膠中，每10μL基質凝膠懸液中含有200-600個隱窩。

將混合懸液置于冰上，并迅速進行下一步操作，以避免基質凝膠凝固。

將基質凝膠懸液稀釋至≥50%的稀釋比例，以確保Arcegel基質凝膠結構在培養過程中的穩定性。

將混合懸液種植在24孔板底部中心，每個孔約30-50μL，避免接觸板壁。

6、培養

將板放置在37°C CO₂培養箱中約30分鐘，直到Arcegel基質凝膠完全固化。

Arcegel基質凝膠完全固化后，沿著孔壁緩慢加入預先準備的小腸類器官培養基，每個孔約800μL。

將24孔板放置在37°C CO₂培養箱中培養。每3天更換一次新鮮培養基，并監測類器官的生長情況。通常，小鼠小腸類器官在5-7天內形成。

實驗結果

Figure Ex vivo culture results of mouse small intestinal organoids.

小腸類器官傳代

在培養5-7天或當小腸類器官中心變黑時，可以進行傳代。預先在培養箱中預熱24孔或12孔板至少30分鐘。移除舊培養基，每個孔加入1mL冷DPBS，等待1分鐘，輕輕提起Arcegel，用1毫升移液管尖端抽吸分散，用注射器吸取懸液，重復此步驟一次，將懸液轉移到5mL離心管中，以1200轉每分鐘，4°C下離心5分鐘，倒掉上清液，并按每個孔1:3的比例傳代。

小腸類器官的冷凍保存

選擇生長旺盛的類器官（通常在傳代后3-4天）進行冷凍保存，每個冷凍管取兩個孔的量。移除培養基，加入1mL細胞冷凍介質，用移液管尖端分散Arcegel，將懸液轉移到冷凍管中，將冷凍管放入冷凍盒中，在-80°C下冷凍1天，然后轉移到液氮中長期保存。

小腸類器官的復蘇

預先在培養箱中預熱24孔板30分鐘。從液氮中取出冷凍管，放入37°C水浴中。一旦冷凍管內容物解凍，用1mL注射器吸取，將細胞懸液轉移到15mL離心管中，以1200轉每分鐘，4°C下離心5分鐘，倒掉上清液，加入5mL冰冷的DPBS重新懸浮，重復離心步驟，倒掉上清液。按照標準類器官培養方法進行類器官培養。

 常見問題

組織消化時應選擇哪種消化液，以及消化時間是多長？

對于組織的消化，可以選擇EDTA或膠原酶。如果消化中空器官，EDTA是合適的，如小腸和胃。膠原酶有多種類型，可以用于多種組織類型，通常與DNase聯合使用。消化時間根據組織類型而有很大差異，從幾分鐘到幾個小時不等，根據具體產品的說明書進行操作。

培養不同孔板的類器官需要多少體積的基質凝膠和培養基？

培養類器官常用的孔板是24孔板，每個孔加入50μL的基質凝膠形成滴液，然后加入500μL的培養基覆蓋滴液。對于96孔板，每個孔加入10μL的基質凝膠形成滴液，然后加入200μL的培養基覆蓋滴液。在6孔板中，每個孔可以種植多個50μL的滴液，并加入2-3mL的培養基覆蓋滴液。