體內成像是指在活生物體中使用成像技術在細胞和分子水平上定性和定量分析生物過程和時間動態的科學學科。技術主要包括生物發光和熒光成像、同位素成像、X射線成像等。其中，生物發光利用熒光素酶基因來標記細胞或DNA，而熒光技術使用熒光蛋白(GFP、EGFP、RFP、YFP)、熒光染料等。，以標記報道基團的表達，隨后使用儀器進行檢測。同位素成像使用放射性同位素作為示蹤劑來標記研究對象，是一種用于體內成像的示蹤分析方法。通過活體成像技術，可以觀察活體動物體內腫瘤生長和轉移、傳染病發展、特定基因表達等生物過程。生物發光在這些應用中特別實用。

Figure 1. Overlay Image of Bioluminescence, Fluorescence, and X-ray Imaging after Tumor Drug Injection (Image source: slidesplayer)

Table 1. Comparison of Different Imaging Technologies

體內成像的應用范圍

生物發光技術的原理如下：

生物發光技術的原理如下: 體內生物發光技術是指利用活生物體中表達的報告基因(如熒光素酶基因)產生熒光素酶蛋白，該蛋白在氧和Mg²⁺存在下與底物熒光素反應，消耗ATP進行氧化反應。這種反應將一些化學能轉化為光能，然后被敏感的CCD設備捕獲，形成離體圖像。熒光素酶報告基因質粒可以插入到各種基因啟動子中，成為特定基因的報告基因。通過檢測報告基因，可以實現對靶基因的監測。

Figure 2. Principle of Bioluminescence In Vivo Imaging Detection

生物熒光本質上是化學熒光。在熒光素酶氧化熒光素的過程中，熒光素可以釋放出波長范圍很寬的可見光的光子，波長范圍為460 ~ 630nm(平均波長為560 nm)。在哺乳動物中，血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，吸收了藍綠色光范圍內的大部分可見光。水和脂類主要吸收紅外光，但對波長為590-800 nm的紅光近紅外光吸收能力都很差。因此，雖然有些散射會消耗波長超過600 nm的光，但大部分可以穿透哺乳動物組織，被高靈敏度的CCD探測器探測到。

Figure 3. Bioluminescent Imaging Detection Results

生物發光成像技術應用

1. 疾病研究

腫瘤學: 將熒光素酶基因插入腫瘤細胞的隨機染色體位點，然后轉移到動物模型中，建立各種腫瘤模型。這使得能夠實時觀察體內腫瘤細胞的增殖、生長和轉移，使研究人員能夠在接近非侵入性的條件下進行觀察和研究。其高靈敏度允許檢測微小的腫瘤病變(少至幾百個細胞)，與傳統方法相比顯著提高了檢測靈敏度，避免了犧牲小鼠導致的組間差異，并節省了動物成本

2. 藥物研究

抗腫瘤藥物研究: 通過給具有腫瘤移植物的小鼠施用不同劑量、持續時間和給藥途徑的抗腫瘤藥物，可以觀察和制定合適的給藥方案和給藥時間。用熒光素酶標記腫瘤細胞以建立各種可見的腫瘤模型允許實時評估各種治療的治療效果。它能夠動態觀察治療后腫瘤細胞的變化，腫瘤細胞是否死亡，腫瘤體積是否縮小，是生物發光體內成像技術最重要的應用領域。

藥物代謝研究: 標記藥物代謝相關基因研究不同藥物對基因表達的影響，間接了解相關藥物在體內的代謝情況。在藥理學研究中，可以將熒光酶報告基因質粒直接摻入載體，觀察藥物載體在體內的靶向器官和分布模式。在藥理學研究中，可以用熒光素酶基因標記感興趣的基因，以觀察藥物作用的途徑。

3. 細胞標記

免疫細胞研究: 標記免疫細胞以觀察免疫細胞對腫瘤細胞的識別和殺傷功能，評估免疫細胞的免疫特異性、增殖、遷移和其他功能。

干細胞研究: 標記組成型表達的基因，在轉基因動物水平標記干細胞，并使用體內生物發光成像技術跟蹤體內干細胞的增殖、分化和遷移。

細胞凋亡: 利用分子生物學方法在熒光素酶兩端附著抑制發光的蛋白抑制劑(如caspase)，但在連接處加入caspase。當細胞經歷凋亡時，胱天蛋白酶表達，切割抑制熒光素酶發光的蛋白質，使熒光素酶開始發光，并觀察細胞的凋亡。

4. 基因表達和功能研究

基因表達與功能: 在目的基因啟動子下游插入熒光素酶基因，并穩定整合到實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。該方法能夠平行表達靶基因和熒光素酶，允許直接觀察靶基因的表達模式，包括數量、時間、位置和影響其表達和功能的因素。

5. 蛋白互作

蛋白質相互作用: 用分離時不單獨發光的熒光酶將兩種不同蛋白質的C端和N端連接起來。如果這兩種蛋白質相互作用，熒光酶的C-末端和N-末端將連接，激活熒光素酶的轉錄表達，導致在底物存在下的生物發光。在體內條件下研究藥物對蛋白質相互作用的影響，可以觀察體內環境對蛋白質相互作用的影響，這是體外實驗無法模擬的。

6. 其他

生物發光的其他應用包括RNAi、蛋白質核轉運等。熒光素酶基因的一端是待研究蛋白質的基因，另一端是已知在細胞核中表達的蛋白質的基因。當細胞核外的蛋白質被轉運到細胞核中時，熒光素酶的N-末端和C-末端靠近在一起，恢復發光。

影響生物成像的因素

1.CCD的性能

2.實驗中使用的細胞和基因的表達

3.熒光標記的選擇

4.熒光素酶成像過程中底物濃度和溫度的影響

5.自體熒光干涉

技術應用展望

活體成像技術使得分子生物學技術能夠從體外研究轉移到體內研究。因此，該技術允許在活體動物中觀察基因表達和細胞活動。它具有檢測靈敏度高、操作簡單等優點，越來越多地應用于醫學和生物學領域。其應用可總結如下:

1.了解疾病機制: 實時成像技術將基因表達和信號轉導等復雜過程轉化為直觀的圖像，使人們能夠在分子和細胞水平上更好地了解疾病機制和特征。

2.疾病早期檢測: 可在疾病早期檢測分子和細胞變異及病理變化。

3.治療效果的評估: 它能夠在體內連續觀察藥物或基因治療的機制和效果。 作為一種非侵入性的體內檢測方法，活體成像技術的優勢在于能夠連續、快速、遠距離、無損傷地獲得人體分子和細胞成分的三維圖像。它可以揭示病變的早期分子生物學特征，促進疾病的早期診斷和治療，為臨床診斷引入新概念。

常見問題

Q1:熒光素的鉀鹽、鈉鹽和游離酸的區別？

答:螢火蟲熒光素酶的底物有三種:熒光素游離酸及其鹽形式，包括鉀鹽和鈉鹽。它們之間的主要區別是: 溶解度:鹽的形式更易溶于水，鉀鹽的溶解度為60毫克/毫升，鈉鹽的溶解度為100毫克/毫升。游離酸難溶于水，可以用碳酸氫鈉溶液弱堿性化。 毒性:鹽的形式更便于使用，特別是在體內成像實驗中，因為它們可以溶于水，從而降低反應毒性。 使用效果:無顯著差異。在體內實驗研究中，通常優選使用鉀鹽。

Q2:怎樣才能探測到人體發出的可見光？

答:冷卻CCD鏡頭的高靈敏度，達到-105°C，確保即使從身體發出的非常少的光子也能被檢測到。絕對密封的暗箱裝置可以屏蔽所有光線，包括輻射。

Q3:CCD鏡頭的低溫對小動物有影響嗎？

答:不會，低溫僅限于CCD鏡頭周圍的小范圍，其余都是室溫。

Q4:與檢測體內綠色熒光蛋白(GFP)的發光相比，使用熒光素進行實時成像有什么優勢？

答:熒光素酶發出的紅移光在組織穿透中比GFP發出的綠光強大約100倍。熒光素酶發光基于與熒光素的相互作用，提供高特異性和信噪比。GFP需要激發光產生反射光，但在檢測過程中，來自小鼠皮毛和皮膚的非特異性熒光會降低信噪比。GFP檢測更適合于體外檢測，而熒光素酶檢測更適合于體內檢測。

Q5:生物發光成像技術在哪些方面優于傳統技術？

答:與傳統技術相比，該技術對研究腫瘤轉移、基因治療、流行病學發病機理研究、干細胞追蹤、白血病相關研究等更敏感。它在腫瘤療效研究中比傳統方法更靈敏，可以通過一系列轉基因動物疾病模型快速直觀地進行相關疾病的發病機理和藥物篩選研究。

Q6:如何用熒光素酶基因標記干細胞？

答:組成型表達的基因可以被標記以創造轉基因小鼠，標記干細胞。造血干細胞可以從這只小鼠的骨髓中取出，并移植到另一只小鼠的骨髓中，從而能夠跟蹤造血干細胞的增殖、分化、遷移以及在全身的遷移過程。另一種方法是用慢病毒標記神經干細胞。

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