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體內(nèi)成像是指在活生物體中使用成像技術(shù)在細(xì)胞和分子水平上定性和定量分析生物過程和時間動態(tài)的科學(xué)學(xué)科。技術(shù)主要包括生物發(fā)光和熒光成像、同位素成像、X射線成像等。其中，生物發(fā)光利用熒光素酶基因來標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)使用熒光蛋白(GFP、EGFP、RFP、YFP)、熒光染料等。，以標(biāo)記報道基團(tuán)的表達(dá)，隨后使用儀器進(jìn)行檢測。同位素成像使用放射性同位素作為示蹤劑來標(biāo)記研究對象，是一種用于體內(nèi)成像的示蹤分析方法。通過活體成像技術(shù)，可以觀察活體動物體內(nèi)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移、傳染病發(fā)展、特定基因表達(dá)等生物過程。生物發(fā)光在這些應(yīng)用中特別實用。

Figure 1. Overlay Image of Bioluminescence, Fluorescence, and X-ray Imaging after Tumor Drug Injection (Image source: slidesplayer)

Table 1. Comparison of Different Imaging Technologies

體內(nèi)成像的應(yīng)用范圍

生物發(fā)光技術(shù)的原理如下：

生物發(fā)光技術(shù)的原理如下: 體內(nèi)生物發(fā)光技術(shù)是指利用活生物體中表達(dá)的報告基因(如熒光素酶基因)產(chǎn)生熒光素酶蛋白，該蛋白在氧和Mg²⁺存在下與底物熒光素反應(yīng)，消耗ATP進(jìn)行氧化反應(yīng)。這種反應(yīng)將一些化學(xué)能轉(zhuǎn)化為光能，然后被敏感的CCD設(shè)備捕獲，形成離體圖像。熒光素酶報告基因質(zhì)粒可以插入到各種基因啟動子中，成為特定基因的報告基因。通過檢測報告基因，可以實現(xiàn)對靶基因的監(jiān)測。

Figure 2. Principle of Bioluminescence In Vivo Imaging Detection

生物熒光本質(zhì)上是化學(xué)熒光。在熒光素酶氧化熒光素的過程中，熒光素可以釋放出波長范圍很寬的可見光的光子，波長范圍為460 ~ 630nm(平均波長為560 nm)。在哺乳動物中，血紅蛋白是吸收可見光的主要成分，吸收了藍(lán)綠色光范圍內(nèi)的大部分可見光。水和脂類主要吸收紅外光，但對波長為590-800 nm的紅光近紅外光吸收能力都很差。因此，雖然有些散射會消耗波長超過600 nm的光，但大部分可以穿透哺乳動物組織，被高靈敏度的CCD探測器探測到。

Figure 3. Bioluminescent Imaging Detection Results

生物發(fā)光成像技術(shù)應(yīng)用

1. 疾病研究

腫瘤學(xué): 將熒光素酶基因插入腫瘤細(xì)胞的隨機(jī)染色體位點(diǎn)，然后轉(zhuǎn)移到動物模型中，建立各種腫瘤模型。這使得能夠?qū)崟r觀察體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的增殖、生長和轉(zhuǎn)移，使研究人員能夠在接近非侵入性的條件下進(jìn)行觀察和研究。其高靈敏度允許檢測微小的腫瘤病變(少至幾百個細(xì)胞)，與傳統(tǒng)方法相比顯著提高了檢測靈敏度，避免了犧牲小鼠導(dǎo)致的組間差異，并節(jié)省了動物成本

2. 藥物研究

抗腫瘤藥物研究: 通過給具有腫瘤移植物的小鼠施用不同劑量、持續(xù)時間和給藥途徑的抗腫瘤藥物，可以觀察和制定合適的給藥方案和給藥時間。用熒光素酶標(biāo)記腫瘤細(xì)胞以建立各種可見的腫瘤模型允許實時評估各種治療的治療效果。它能夠動態(tài)觀察治療后腫瘤細(xì)胞的變化，腫瘤細(xì)胞是否死亡，腫瘤體積是否縮小，是生物發(fā)光體內(nèi)成像技術(shù)最重要的應(yīng)用領(lǐng)域。

藥物代謝研究: 標(biāo)記藥物代謝相關(guān)基因研究不同藥物對基因表達(dá)的影響，間接了解相關(guān)藥物在體內(nèi)的代謝情況。在藥理學(xué)研究中，可以將熒光酶報告基因質(zhì)粒直接摻入載體，觀察藥物載體在體內(nèi)的靶向器官和分布模式。在藥理學(xué)研究中，可以用熒光素酶基因標(biāo)記感興趣的基因，以觀察藥物作用的途徑。

3. 細(xì)胞標(biāo)記

免疫細(xì)胞研究: 標(biāo)記免疫細(xì)胞以觀察免疫細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別和殺傷功能，評估免疫細(xì)胞的免疫特異性、增殖、遷移和其他功能。

干細(xì)胞研究: 標(biāo)記組成型表達(dá)的基因，在轉(zhuǎn)基因動物水平標(biāo)記干細(xì)胞，并使用體內(nèi)生物發(fā)光成像技術(shù)跟蹤體內(nèi)干細(xì)胞的增殖、分化和遷移。

細(xì)胞凋亡: 利用分子生物學(xué)方法在熒光素酶兩端附著抑制發(fā)光的蛋白抑制劑(如caspase)，但在連接處加入caspase。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷凋亡時，胱天蛋白酶表達(dá)，切割抑制熒光素酶發(fā)光的蛋白質(zhì)，使熒光素酶開始發(fā)光，并觀察細(xì)胞的凋亡。

4. 基因表達(dá)和功能研究

基因表達(dá)與功能: 在目的基因啟動子下游插入熒光素酶基因，并穩(wěn)定整合到實驗動物染色體中，形成轉(zhuǎn)基因動物模型。該方法能夠平行表達(dá)靶基因和熒光素酶，允許直接觀察靶基因的表達(dá)模式，包括數(shù)量、時間、位置和影響其表達(dá)和功能的因素。

5. 蛋白互作

蛋白質(zhì)相互作用: 用分離時不單獨(dú)發(fā)光的熒光酶將兩種不同蛋白質(zhì)的C端和N端連接起來。如果這兩種蛋白質(zhì)相互作用，熒光酶的C-末端和N-末端將連接，激活熒光素酶的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致在底物存在下的生物發(fā)光。在體內(nèi)條件下研究藥物對蛋白質(zhì)相互作用的影響，可以觀察體內(nèi)環(huán)境對蛋白質(zhì)相互作用的影響，這是體外實驗無法模擬的。

6. 其他

生物發(fā)光的其他應(yīng)用包括RNAi、蛋白質(zhì)核轉(zhuǎn)運(yùn)等。熒光素酶基因的一端是待研究蛋白質(zhì)的基因，另一端是已知在細(xì)胞核中表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因。當(dāng)細(xì)胞核外的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中時，熒光素酶的N-末端和C-末端靠近在一起，恢復(fù)發(fā)光。

影響生物成像的因素

1.CCD的性能

2.實驗中使用的細(xì)胞和基因的表達(dá)

3.熒光標(biāo)記的選擇

4.熒光素酶成像過程中底物濃度和溫度的影響

5.自體熒光干涉

技術(shù)應(yīng)用展望

活體成像技術(shù)使得分子生物學(xué)技術(shù)能夠從體外研究轉(zhuǎn)移到體內(nèi)研究。因此，該技術(shù)允許在活體動物中觀察基因表達(dá)和細(xì)胞活動。它具有檢測靈敏度高、操作簡單等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和生物學(xué)領(lǐng)域。其應(yīng)用可總結(jié)如下:

1.了解疾病機(jī)制: 實時成像技術(shù)將基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等復(fù)雜過程轉(zhuǎn)化為直觀的圖像，使人們能夠在分子和細(xì)胞水平上更好地了解疾病機(jī)制和特征。

2.疾病早期檢測: 可在疾病早期檢測分子和細(xì)胞變異及病理變化。

3.治療效果的評估: 它能夠在體內(nèi)連續(xù)觀察藥物或基因治療的機(jī)制和效果。 作為一種非侵入性的體內(nèi)檢測方法，活體成像技術(shù)的優(yōu)勢在于能夠連續(xù)、快速、遠(yuǎn)距離、無損傷地獲得人體分子和細(xì)胞成分的三維圖像。它可以揭示病變的早期分子生物學(xué)特征，促進(jìn)疾病的早期診斷和治療，為臨床診斷引入新概念。

常見問題

Q1:熒光素的鉀鹽、鈉鹽和游離酸的區(qū)別？

答:螢火蟲熒光素酶的底物有三種:熒光素游離酸及其鹽形式，包括鉀鹽和鈉鹽。它們之間的主要區(qū)別是: 溶解度:鹽的形式更易溶于水，鉀鹽的溶解度為60毫克/毫升，鈉鹽的溶解度為100毫克/毫升。游離酸難溶于水，可以用碳酸氫鈉溶液弱堿性化。 毒性:鹽的形式更便于使用，特別是在體內(nèi)成像實驗中，因為它們可以溶于水，從而降低反應(yīng)毒性。 使用效果:無顯著差異。在體內(nèi)實驗研究中，通常優(yōu)選使用鉀鹽。

Q2:怎樣才能探測到人體發(fā)出的可見光？

答:冷卻CCD鏡頭的高靈敏度，達(dá)到-105°C，確保即使從身體發(fā)出的非常少的光子也能被檢測到。絕對密封的暗箱裝置可以屏蔽所有光線，包括輻射。

Q3:CCD鏡頭的低溫對小動物有影響嗎？

答:不會，低溫僅限于CCD鏡頭周圍的小范圍，其余都是室溫。

Q4:與檢測體內(nèi)綠色熒光蛋白(GFP)的發(fā)光相比，使用熒光素進(jìn)行實時成像有什么優(yōu)勢？

答:熒光素酶發(fā)出的紅移光在組織穿透中比GFP發(fā)出的綠光強(qiáng)大約100倍。熒光素酶發(fā)光基于與熒光素的相互作用，提供高特異性和信噪比。GFP需要激發(fā)光產(chǎn)生反射光，但在檢測過程中，來自小鼠皮毛和皮膚的非特異性熒光會降低信噪比。GFP檢測更適合于體外檢測，而熒光素酶檢測更適合于體內(nèi)檢測。

Q5:生物發(fā)光成像技術(shù)在哪些方面優(yōu)于傳統(tǒng)技術(shù)？

答:與傳統(tǒng)技術(shù)相比，該技術(shù)對研究腫瘤轉(zhuǎn)移、基因治療、流行病學(xué)發(fā)病機(jī)理研究、干細(xì)胞追蹤、白血病相關(guān)研究等更敏感。它在腫瘤療效研究中比傳統(tǒng)方法更靈敏，可以通過一系列轉(zhuǎn)基因動物疾病模型快速直觀地進(jìn)行相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)理和藥物篩選研究。

Q6:如何用熒光素酶基因標(biāo)記干細(xì)胞？

答:組成型表達(dá)的基因可以被標(biāo)記以創(chuàng)造轉(zhuǎn)基因小鼠，標(biāo)記干細(xì)胞。造血干細(xì)胞可以從這只小鼠的骨髓中取出，并移植到另一只小鼠的骨髓中，從而能夠跟蹤造血干細(xì)胞的增殖、分化、遷移以及在全身的遷移過程。另一種方法是用慢病毒標(biāo)記神經(jīng)干細(xì)胞。

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