在RT-QPCR實驗中，已經將RNA逆轉錄成cDNA，但獲得的cDNA，大家通常會用Nanodrop來測定其濃度和純度，這樣正確嗎？得到的cDNA是否存在基因組DNA（gDNA）污染從而影響后續的qPCR實驗呢？現在就為大家解讀一下。

cDNA不需要用Nanodrop測量濃度和純度

為什么逆轉錄后的cDNA不需要用Nanodrop來檢測濃度與純度呢？因為逆轉錄后的產物是一個混合體系（含有cDNA、未完全逆轉錄的RNA、dNTP、殘余的引物以及各種蛋白和鹽離子等成分），會干擾cDNA的吸光度。此外，260 nm是核酸吸收峰最高的位置，在這個位置，1 OD（optical density，光密度）的吸光度分別相當于50 ng/μL的雙鏈DNA，37 ng/μL的單鏈DNA，40 ng/μL的RNA，30 ng/μL的寡核苷酸（dNTP）。因此，就dNTP而言，即使cDNA濃度一樣，dNTP也會嚴重干擾其測定結果。

為此，我們專門進行了驗證，以進一步說明dNTP 投入量對cDNA濃度檢測結果存在的影響。以小鼠肌肉組織RNA為模板，采用不同品牌試劑分別進行逆轉錄實驗，RNA 投入量為500 ng，逆轉錄體系及程序分別按各自說明書進行。采用Nanodrop測定cDNA濃度，并取相同體積cDNA分別進行qPCR實驗，結果證明：不同品牌逆轉錄產品的cDNA濃度相差較大，但定量實驗Ct值幾乎一致。逆轉錄體系中dNTP 投入量的多少會使cDNA濃度的測定結果產生較大差異，但最終Ct值幾乎一致。

圖1.qPCR檢測結果△Ct＜1，且 Ct 值與 Nanodrop 定量結果無線性關系

因此，cDNA濃度的測定值是不準確的，逆轉錄實驗之后無需測定濃度。RT-qPCR是一個多步驟連貫實驗，正是因為cDNA無法鑒定，只能通過后續qPCR實驗才能呈現結果。

gDNA污染的識別與去除

gDNA的污染主要來源于RNA模板， 那如何識別RNA模板中是否仍含有gDNA殘留呢？可以在逆轉錄之前將RNA模板進行瓊脂糖凝膠電泳驗證。如下圖所示，泳道上部有明顯的高分子雜帶，則可能有gDNA的殘留，不建議用于后續的qPCR實驗，會對實驗的準確性造成影響。

 圖2. 高質量RNA（左）和RNA中有gDNA（右）

如果逆轉錄前沒有確認模板中是否含有gDNA，可以在qPCR實驗中設立NRC陰性對照組（以未逆轉錄的RNA作為模板）驗證，如果NRC具有明顯的擴增，表明RNA中可能含有gDNA污染。

那么該如何去除gDNA污染呢？通?？梢栽赗NA提取時或逆轉錄前用DNA酶或gDNA清除劑去除gDNA。為此，Arcegen提供了1st Strand cDNA Synthesis SuperMix (gDNA digester plus, for qPCR)（Cat#N132061）可有效去除逆轉錄過程中gDNA的殘留。

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