01 研究背景
睡眠對健康和生活至關重要，但睡眠碎片化(SF)等睡眠障礙在2型糖尿病(T2DM)患者中非常普遍。有臨床證據表明非酒精性脂肪肝是心力衰竭的主要危險因素，但SF等睡眠障礙引起的肝損傷是否會導致心血管疾病(CVD)的發展仍未得到探索。近期山東大學顧俊蓮教授團隊在Acta Pharmaceutica Sinica B (IF 14.7)發表文章“Diabetes-associated sleep fragmentation impairs liver and heart function via SIRT1dependent epigenetic modulation of NADPH oxidase 4”，發現SF導致明顯的肝臟有害表型以及心臟結構和功能的異常，對肝臟Nox4或Sirt1進行基因操作可以通過降低H3K27ac水平有效改善肝臟病理進展，從而緩解SF引起的持續性心血管疾病。
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基因信息
Nox4：尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4
Sirt1：NAD+依賴性脫乙酰酶
病毒產品
AAV8-TBG-CTL
AAV8-TBG-shNox4
AAV8-TBG-Sirt1
實驗動物
2型糖尿病模型小鼠
注射方式
尾靜脈注射
注射量
200μL，5×1011vg
AAV8-TBG-shNox4和AAV8-TBG-Sirt1在小鼠中成功介導Nox4敲低和Sirt1過表達
02 結果展示
1. NOX4高表達導致SF處理的T2DM小鼠肝功能受損
作者發現SF顯著促進了T2DM小鼠肝臟中脂質積聚、炎癥和纖維化，已有研究表明SF與氧化應激密切相關，因此作者研究了SF對T2DM小鼠氧化應激誘發的影響，發現SF可顯著誘導肝臟ROS生成、MDA水平升高和GSH水平降低。NOX酶是ROS的主要生成者，作者發現肝臟組織中NOX4蛋白表達被SF上調，RNA測序數據表明Nox4的上調在酒精性肝炎、肝細胞癌、急性肝衰竭和肝毒性患者中起著關鍵作用，肝臟Nox4表達與肝功能障礙之間存在正相關性。作者在小鼠原代肝細胞為了進一步驗證上述體內結果，用H2O2處理小鼠原代肝細胞，模擬體內SF狀態，發現H2O2處理導致細胞ROS、NOX4升高，促炎因子激活。這些結果表明NOX4介導的氧化應激可能在肝損傷和相關炎癥反應的病理過程中起關鍵作用。
圖1 NOX4高表達導致SF處理的T2DM小鼠肝功能受損
2. SF在表觀遺傳水平上促進NOX4的表達
鑒于組蛋白的乙?；綍绊懟蜣D錄，作者研究了Nox4基因相關的組蛋白表觀遺傳修飾的狀態，以闡明導致SR后持續性肝損傷的潛在機制，確定了Nox4啟動子區四種潛在的組蛋白修飾，并通過ChIP-qPCR檢測四種組蛋白修飾與Nox4啟動子區的結合效率，發現Nox4啟動子區H3K27ac的富集顯著增加。了進一步研究Nox4表觀遺傳修飾及其在小鼠肝臟組織中持續上調的意義，作者使用AAV8-TBG-shNox4構建了肝臟特異性Nox4敲低小鼠，發現Nox4敲低顯著減輕了SF誘導的肝臟異常形態、脂質積累、纖維化和ROS生成，肝臟和血清中GSH和MDA水平以及ALT和AST活性顯著改善，促炎細胞因子的表達和炎性細胞浸潤以及細胞氧化還原狀態的失衡得到恢復。此外Nox4 敲低還有效消除了SF誘導的心臟功能障礙和心肌纖維化并逆轉了血清中的炎癥因子水平，表明NOX4抑制在持續性心肝損傷中發揮保護性抗氧化和抗炎功能。進一步研究發現SIRT1調控Nox4的表觀遺傳修飾，從而影響肝臟氧化應激和炎癥反應。
圖2 SF在表觀遺傳水平上促進NOX4的表達
3. Sirt1的肝臟特異性過表達可逆轉SF誘導的T2DM小鼠的持續氧化和炎癥應激
為了闡明SIRT1激活對SF誘導的T2DM小鼠持續性損傷的影響，作者使用AAV8-TBG-Sirt1實現了肝臟特異性Sirt1過表達。與對照病毒相比，Sirt1過表達明顯減少了脂質沉積、纖維化和ROS積累，肝臟和血清中的MDA水平顯著降低，ALT和AST活性顯著降低，GSH 水平顯著升高。此外，肝臟特異性Sirt 過表達導致肝臟抗氧化水平升高，有效緩解了SF誘導的持續性肝臟炎癥反應。RSV是SIRT1激活劑，在SF治療的T2DM小鼠中表現出一致的抗炎和抗氧化保肝作用。在SF治療的T2DM小鼠中，肝臟特異性Sirt1過表達或RSV治療后，心臟功能障礙和心肌纖維化得到顯著改善，SIRT1的上調抑制了血清中的炎癥因子水平，并有效改善了SF治療的T2DM小鼠的免疫功能。這些數據表明，通過遺傳或藥理學方法激活SIRT1是一種有前途的治療策略，可以減輕SF對T2DM小鼠造成的破壞性影響。
圖3 Sirt1的肝臟特異性過表達可逆轉SF誘導的T2DM小鼠的持續氧化和炎癥應激
03 實驗結論
本研究證明即使在睡眠模式恢復正常后，SF誘導的T2DM小鼠肝臟氧化和炎癥損傷仍然存在。這種持續的損傷顯著影響了肝臟和心臟之間的交流，最終導致心血管損傷。受SIRT1介導的H3K27去乙?；刂频腘OX4持續高表達在此過程中起著關鍵作用，SF后BMAL1依賴的Sirt1轉錄可以精細協調晝夜節律和肝臟損傷。肝臟特異性Nox4或Sirt1的基因操作，以及針對NOX4或SIRT1的藥物干預，對SF誘導的肝臟氧化和炎癥表型發揮了強大的保護作用，突出了肝臟SIRT1/NOX4 通路作為T2DM合并SF患者CVD有效治療靶點的重要性。